組合策略提高普魯蘭酶在枯草芽胞桿菌中的表達

普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)屬于α-淀粉酶家族,是一種常在工業(yè)上使用的淀粉酶,它可以特異性的水解支鏈淀粉、糊精、普魯蘭糖等的α-1,6糖苷鍵[1],以達到脫支的作用。依據(jù)普魯蘭酶水解糖苷鍵原理的不同和生成產(chǎn)物的差異,其主要分為 I 型普魯蘭酶和 II 型普魯蘭酶[2]。I 型普魯蘭酶負責水解α-1,6 糖苷鍵,產(chǎn)物是麥芽三糖和一些線性寡糖；II 型普魯蘭酶,是一種雙功能酶,它不僅可以水解 α-1,6 糖苷鍵,還能夠隨機水解淀粉直鏈上的 α-1,4 糖苷鍵,生成還原性末端[3]。因此在糖化過程中,普魯蘭酶常與其他淀粉酶如糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶或環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶復配來快速分解淀粉。此外,普魯蘭酶也被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)果葡糖漿、抗性淀粉、乙醇燃料、啤酒等其他領(lǐng)域[4]。

盡管已有多種生產(chǎn)普魯蘭酶的微生物被發(fā)現(xiàn),但野生型菌的普魯蘭酶產(chǎn)量偏低,難以實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。隨著基因工程和酶工程的迅速發(fā)展,普魯蘭酶最近在多種模式菌株中實現(xiàn)了異源表達,包括大腸桿菌[5]、枯草芽胞桿菌[6]、地衣芽胞桿菌[7]、短小芽胞桿菌[8]、畢赤酵母等[9]。但大腸桿菌和短小芽胞桿菌不是安全菌株,畢赤酵母的誘導表達需要甲醇的添加,會導致食品安全問題,且畢赤酵母的發(fā)酵時間較長。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規(guī)定,食品級普魯蘭酶生產(chǎn)菌株僅為產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(Bacillus acidopullulyticus)、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformi)和長野解普魯蘭桿菌(Pullulanibacillus naganoensis)。總體來看,提高普魯蘭酶在B.subtilis中的表達對于滿足普魯蘭酶工業(yè)應(yīng)用需求具有非常重要的意義。B.subtilis是革蘭氏陽性菌種的模式菌株,其作為表達宿主被廣泛使用,具有以下諸多優(yōu)點：(1)屬于公認的食品級安全菌株(GRAS認證)[10]；(2)無明顯的密碼子偏好性,表達異源蛋白時具有天然優(yōu)勢[11]；(3)分泌能力強,其具有Sec、Tat等4條蛋白分泌途徑以及大量鑒定的信號肽,可以有效地分泌蛋白至胞外以及簡化后續(xù)純化過程[12]；(4)生長速率快,培養(yǎng)、發(fā)酵周期短[11]；(5)具有透徹的研究背景和豐富的基因改造工具[13]。

本研究中,將融合信號肽AprE[14]的Bacillus deramificans普魯蘭酶基因在B.subtilis WB600中表達。先后通過啟動子類型優(yōu)化、培養(yǎng)基組分單因素和響應(yīng)面優(yōu)化,提高了普魯蘭酶的表達水平,并在5 L罐上進行放大培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株B.subtilis WB600-E.coli JM109為實驗室保藏；質(zhì)粒pP43 NMK由實驗室保存;質(zhì)粒pUC57-Pul由上海生工公司合成,其含有B.subtilis內(nèi)源信號肽AprE和來源于Bacillus deramificans的普魯蘭酶基因(GenBank:KT897705.1),并根據(jù)B.subtilis密碼子偏好性進行優(yōu)化。

1.1.2 引物

本文中的引物如表1所示。

表1 本研究所用的引物

Table 1 Primers used in this study

1.1.3 試劑

Prime STARDNA聚合酶、DNA Ligation Kit 試劑盒、DNA連接酶(solution I)、瓊脂糖,TaKaRa公司(大連)；柱回收試劑盒、膠回收試劑盒,Invitrogen；質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐青霉素、卡娜霉素、即用型無縫克隆試劑盒、尿素、硫酸銨、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖,生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白胨、酵母粉,OXIOD公司；玉米漿,上海源葉生物科技有限公司；SDS-PAGE蛋白電泳試劑盒和標準蛋白,Invitrogen；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,蛋白胨10,氯化鈉10。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加2%瓊脂粉。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油5,蛋白胨12,酵母粉 24,磷酸二氫鉀2.31,磷酸氫二鉀 16.37。

5 L罐補料培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 500,玉米漿 65,酵母浸膏 35,CaCl2 0.13。

1.2 實驗方法

1.2.1 普魯蘭酶基因的合成與表達載體的構(gòu)建

利用引物Pul-F/R PCR擴增普魯蘭酶基因,引物Pul-F/R-plasmid擴增pP43 NMK質(zhì)粒骨架,通過無縫克隆試劑盒,將片段融合構(gòu)建質(zhì)粒P43-Pul。質(zhì)粒的提取參考試劑盒說明書。

1.2.2 普魯蘭酶重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli 109感受態(tài)細胞中,在含質(zhì)量濃度100 μg/mL氨芐西林的LB固定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以Pul-F和Clone-R為引物,對轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證。陽性轉(zhuǎn)化子進行基因測序確認。

1.2.3 B.subtilis轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)與表達

將測序正確后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.subtilis,并在LB固定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將單菌落接種到含有20 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h活化種子液。接著取1 mL種子液轉(zhuǎn)接至裝有25 mL TB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶內(nèi),37 ℃下發(fā)酵,定時測量細胞OD600值和普魯蘭酶酶活力。以上培養(yǎng)基添加卡納霉素(50 μg/mL)。

1.2.4 啟動子表達變體的構(gòu)建

根據(jù)文獻報道,選用強組成型啟動子(PlytR,P223,P556和P566和P6366)[15-17]、誘導型啟動子(PxylA)[18]、自誘導型啟動子(PsrfA)[15]分別替換原有組成型啟動子P43(啟動子序列見表2)。P223、P566和P6366均為短啟動子,將其直接設(shè)計在引物的非同源部分。所用引物對為223-F/223-R、566-F/566-R、6 366-F/6 366-R,PCR產(chǎn)物通過DNA Ligation Kit連接試劑盒,環(huán)化后構(gòu)建啟動子變體。剩余啟動子通過引物對lytR-F/R、xylA-F/R和srfA-F/R擴增,通過引物對lytR-plasmid-F/R、xylA-plasmid-F/R、srfA-plasmid-F/R擴增質(zhì)粒載體,并通過一步克隆試劑盒構(gòu)建啟動子變體。重組質(zhì)粒的提取和鑒定同上述方法。

表2 本研究所選用的啟動子

Table 2 The promoters selected in this study

1.2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基配方和產(chǎn)酶條件

以TB培養(yǎng)基為基礎(chǔ),選用2種無機氮源(尿素、硫酸銨)、3種有機氮源(胰蛋白胨、玉米漿、酵母膏)替換原有蛋白胨；選用2種單糖碳源(葡萄糖、果糖)、2種雙糖碳源(蔗糖、麥芽糖)替代原有甘油；額外添加1 mmol/L金屬離子(MgCl2、ZnCl2、CaCl2、FeCl3、AlCl3)考察金屬離子的影響。

1.2.6 重組B.subtilis的5 L罐發(fā)酵

接種生長在抗性平板上的單菌落至多個含有50 mL LB培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中,培養(yǎng)8 h以達到對數(shù)期,活化種子液。然后將種子液按照5%的體積比接種至含有2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。以50%的氨水和30%的磷酸控制pH在7.0。發(fā)酵溫度控制在37 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧偶聯(lián),設(shè)定值為30%(攪拌轉(zhuǎn)速下限300 r/min,上限900 r/min),通氣量為1.5 vvm。實時監(jiān)測殘?zhí)侵登闆r,當殘?zhí)?lt;5 g/L時(底物耗盡,溶氧開始反彈)進行補料控制,使殘?zhí)蔷S持在10 g/L左右。實時監(jiān)測細胞生長和酶活力,當酶活性數(shù)值連續(xù)2次下降時,終止發(fā)酵。

1.2.7 普魯蘭酶酶活力檢測和SDS-PAGE分析

分別取1 mL的底物(1.0%普魯蘭酶溶液)和0.9 mL的0.1 mol/L pH 4.5的醋酸緩沖液于試管中,60 ℃水浴預(yù)熱10 min左右。加入0.1 mL稀釋的酶液樣品,振蕩混勻,反應(yīng)10 min,加入2 mL DNS終止反應(yīng),沸水浴7 min,冰水中冷卻。向上述反應(yīng)體系中加入10 mL的蒸餾水,混勻,在540 nm下測量其吸光值[19]。

蛋白樣品上樣量為 5 μL,與4×SDS蛋白上樣緩沖液按體積比3∶1混合、煮沸,進行SDS-PAGE凝膠電泳,設(shè)置恒壓120 V。

2 結(jié)果分析

2.1 重組B.subtilis的構(gòu)建

2.1.1 普魯蘭酶表達質(zhì)粒的構(gòu)建

為實現(xiàn)普魯蘭酶在B.subtilis中的胞外表達,根據(jù)B.subtilis密碼子偏好性合成N-端融合信號肽AprE的普魯蘭酶基因,并克隆至質(zhì)粒pUC57。再以重組質(zhì)粒為模板,擴增AprE-普魯蘭酶基因片段。結(jié)果如圖1-a所示,PCR產(chǎn)物在2 000～3 000 bp間有明顯條帶,與目的基因的理論大小(2 259 bp)一致。使用引物對Pul-plasmid-F/R擴增pP43 NMK表達質(zhì)粒骨架。如圖1-b所示,PCR產(chǎn)物在7 500 bp處有明顯條帶,與質(zhì)粒大小吻合。以上片段通過無縫克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒P43-Pul,導入E.coli JM109中,轉(zhuǎn)化子PCR驗證。如圖1-c所示,PCR產(chǎn)物與目標條帶的理論大小(2 767 bp)一致。轉(zhuǎn)化子測序正確后,獲得普魯蘭酶表達質(zhì)粒P43-Pul。

a-合成基因片段PCR擴增；b-pP43 NMK質(zhì)粒骨架擴增；c-重組菌菌落PCR

a-M-1 kb Marker,1-Pul合成基因擴增片段驗證；b-M-15 kb Marker,1-pP43 NMK質(zhì)粒擴增片段驗證；c-轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗證

圖1 普魯蘭酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證

Fig.1 Construction and verification of pullulanase recombinant plasmid

2.1.2 普魯蘭酶表達質(zhì)粒在B.subtilis中的表達

將質(zhì)粒P43-Pul轉(zhuǎn)入B.Subtilis WB600并在含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基上生長。將單菌落經(jīng)LB種子液活化后,接種至TB培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程曲線如圖2所示,通過測量取樣,發(fā)酵36 h后普魯蘭酶達到最高酶活力,為29.6 U/mL。

圖2 普魯蘭酶在B.subtilis WB600中的發(fā)酵過程曲線

Fig.2 Fermentation curve of pullulanase in B.subtilis WB600

發(fā)酵結(jié)束后,對上清液進行SDS-PAGE,如圖3所示。根據(jù)氨基酸序列預(yù)測該酶的理論分子質(zhì)量為79 kDa,在約79 kDa處檢測出明顯條帶,說明目的基因成功在B.subtilis中異源表達。

M-蛋白質(zhì)marker；1-普魯蘭酶發(fā)酵12 h的粗酶液；2-普魯蘭酶發(fā)酵24 h的粗酶液；3-普魯蘭酶發(fā)酵30 h的粗酶液；4-普魯蘭酶發(fā)酵36 h的粗酶液；5-普魯蘭酶發(fā)酵42 h的粗酶液

圖3 重組普魯蘭酶的SDS-PAGE電泳分析圖

Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant pullulanase

2.1.3 普魯蘭酶啟動子的優(yōu)化

蛋白的表達始于靶基因的有效轉(zhuǎn)錄,而轉(zhuǎn)錄強度直接受啟動子控制[20]。為進一步增強普魯蘭酶表達,選取多種強啟動子替換原有啟動子P43,包括合成組成型P223[16],P556[16],P566[16]和P6366[17],天然組成型PlytR[15],誘導型PxylA[18]和自誘導型PsrfA[15](表2)。誘導型啟動子PxylA在菌體OD600值達到0.4時添加3%的木糖；其他啟動子發(fā)酵條件同P43一致。搖瓶發(fā)酵后,統(tǒng)一在36 h測定普魯蘭酶酶活力。如圖4所示,除合成啟動子P223和自誘導啟動子PsrfA,其他5株啟動子替換的重組菌酶活力均有明顯提高。在P566啟動子下,重組菌的酶活力在36 h達到最高值58.1 U/mL,是優(yōu)化前的1.96倍(圖4)。這說明通過替換強啟動子來提高蛋白表達是一種有效的策略。然而,P566啟動子是P43啟動子強度的500多倍[16],但在普魯蘭酶表達中效果有所下降。一個重要原因是蛋白表達是復雜過程,既取決于酶基因序列及其表達元件(如啟動子),也受制于發(fā)酵條件。

圖4 啟動子對普魯蘭酶表達的影響

Fig.4 The influence of promoters on the expression of pullulanase

2.2 發(fā)酵條件對普魯蘭酶表達的影響

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

不同種類的培養(yǎng)基對重組菌的生長與產(chǎn)酶影響較大。本研究首先使用單因素優(yōu)化,來確定培養(yǎng)基的最佳組分,發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。

圖5 培養(yǎng)基組分對普魯蘭酶表達的影響

Fig.5 Effect of medium components on the expression of pullulanase

氮源是微生物生長所必須的基礎(chǔ)物質(zhì)[21]。本研究使用了2種無機氮源(尿素和硫酸銨)、3種有機氮源(胰蛋白胨、玉米漿、酵母膏)來考察對于普魯蘭酶生產(chǎn)的影響。如圖5所示,以玉米漿為氮源時酶活力最高為66.3 U/mL,其余依此為胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、尿素?？傮w而言,有機氮源更有利于酶的表達。碳源是是蛋白中心骨架構(gòu)成的重要元素[22]。如圖5所示,以葡萄糖為碳源時酶活力最高,為61.2 U/mL。金屬離子可以改變細胞膜通透性以促進蛋白分泌[23]。本研究選擇了5種金屬離子考察對產(chǎn)酶的影響。盡管添加Ca2+時可提高18%的酶活力,但Zn2+、Al3+添加后卻導致酶活力大幅下降,說明金屬離子并不一定利于普魯蘭酶胞外表達,跟金屬離子價位也無明顯關(guān)系。此外,不同培養(yǎng)基可使酶活力差異達到1.7倍,進一步了證明發(fā)酵條件對酶表達的重要性。然而,將各單因素最佳條件直接組合,會陷入局部最優(yōu)的情況,而非全局最佳的情況。

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以響應(yīng)面設(shè)計原理,對每個組分質(zhì)量濃度進行優(yōu)化并設(shè)計了4因素3水平 BBD 實驗,因素編碼情況見表3,通過Design Expert V8.06設(shè)計實驗及分析結(jié)果(表4),模型評價結(jié)果見表5所示。

表3 因素水平編碼表

Table 3 Coding table of factors and levels

表4 Box-Behnken設(shè)計方案及結(jié)果

Table 4 Design and results of Box-Behnken

表5 回歸模型方差分析表

Table 5 Variance analysis of experimental results

根據(jù)BBD實驗設(shè)計,建立了酶活力與培養(yǎng)基組分間的回歸方程：酶活力=15.70+1.52A+1.71B-2.61C+101.80D+0.08AB+0.31AC-1.70AD-0.30BC-0.59BD+1.29CD-0.18A2-0.03B2+1.04C2-39.40D2。由模型顯著性檢驗表明,P值和失擬項分別為0.001 3(顯著)和0.294 8(不顯著),說明擬合程度較好。此外,模型R2為0.85,說明能解釋約85%總變異,可信度較好?；诖?軟件預(yù)測培養(yǎng)基的最佳組分為玉米漿14.8 g/L,蛋白胨7.3 g/L,葡萄糖17.5 g/L,Ca2+1.2 mmol/L。在此條件下,發(fā)酵36 h后酶活力達到129.4 U/mL,相比培養(yǎng)基優(yōu)化前提高了4.4倍。與單因素優(yōu)化相比,基于模型擬合的響應(yīng)面優(yōu)化效果更為明顯；與全因子組合實驗(43)相比,實驗方案僅有29組,顯著減少了實驗工作量。

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L罐培養(yǎng)

在5 L罐上進行放大培養(yǎng),發(fā)酵過程如圖6所示。接種8 h內(nèi),殘?zhí)墙档?7%為14.1 g/L,OD600達到12(為最大值的26%)。表明此時為細胞生長前期,對營養(yǎng)物質(zhì)需求較少。此后,OD600迅速增加,殘?zhí)菐缀跖cOD600完全呈相反態(tài)勢,快速降低。在24 h左右,OD600首次超過最大值的80%,此后細胞生長明顯放緩。恰好此時殘?zhí)且彩状谓档椭裂a料時間點(溶氧開始反彈,殘?zhí)菫?.65,<5)。由于B.subtilis在營養(yǎng)貧瘠時會形成芽胞以抵御不良情況,并且芽胞形成是不可逆,對于工業(yè)生產(chǎn)不利。并且芽胞也是食品保存的一大障礙和安全隱患[24]?？梢酝ㄟ^補加葡萄糖來抑制芽胞的形成,但是過量的葡萄糖會導致葡萄糖效應(yīng),限制菌體生長和酶蛋白的合成[24]。因此本實驗保持葡萄糖質(zhì)量濃度在10 g/L左右以平衡兩者關(guān)系。如圖5所示,在補料后,酶活力跟細胞生長出現(xiàn)了2次上升的態(tài)勢。最終在發(fā)酵53 h后,酶活力達到最高,為226.4 U/mL。根據(jù)發(fā)酵過程曲線可知,酶活力與OD600曲線緊密偶聯(lián),符合P566組成型啟動子的特征[16](圖6、圖7)。但是酶合成和細胞生長同步,在一定程度上帶來細胞代謝壓力,影響細胞最終的產(chǎn)酶能力[25]。為進一步提高產(chǎn)酶水平,將對重組菌的發(fā)酵進行過程控制,包括分批、分階段的溫度和補料控制策略等。

圖6 重組普魯蘭酶在5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵過程曲線

Fig.6 The fermentation process curve of pullulanase in 5 L fermenter

圖7 重組普魯蘭酶在5 L罐的SDS-PAGE電泳分析圖

Fig.7 SDS-PAGE analysis of the recombinant pullulanase in 5 L fermenter

3 結(jié)論

本文成功將來源于Bacillus deramificans的普魯蘭酶基因在B.subtilis中異源表達。通過強啟動子替換、培養(yǎng)基組成的單因素和響應(yīng)面優(yōu)化策略,使酶活力提高至優(yōu)化前的4.4倍。最后在5 L罐進行放大培養(yǎng),通過葡萄糖補料控制,在發(fā)酵53 h后達到最高酶活力,是初始優(yōu)化前的7.7倍。以上說明通過優(yōu)化基因的內(nèi)在調(diào)控元件和外在發(fā)酵環(huán)境,可以顯著增強B.subtilis目的蛋白的表達,為應(yīng)用枯草芽胞桿菌生產(chǎn)其他異源蛋白提供了方法學參考。