富脯氨酸膠原蛋白的重組表達(dá)及熱穩(wěn)定性研究

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物中含量最豐富的蛋白質(zhì),占人體總蛋白的30%左右,是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分[1-2]。膠原蛋白是由3條肽鏈相互纏繞構(gòu)成三股螺旋結(jié)構(gòu)并自組裝形成的結(jié)構(gòu)蛋白,是組織的主要蛋白質(zhì),包括皮膚、骨骼、韌帶、肌腱和軟骨等,為生物體增加了熱穩(wěn)定性、彈性和機(jī)械強(qiáng)度,起著支撐器官、保護(hù)肌體的功能[3]。目前,膠原蛋白的制備主要可分為：化學(xué)合成膠原多肽、動(dòng)植物細(xì)胞表達(dá)、動(dòng)物提取[4-5]和微生物表達(dá)[6-8]。以化學(xué)合成多肽為基底的膠原材料雖然可控性強(qiáng)、純度高,但其價(jià)格昂貴、不適合批量生產(chǎn)；動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)難度高、價(jià)格高昂、周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低；目前動(dòng)物組織提取為制備膠原蛋白的主要途徑,然而其容易攜帶病原體。相比于以上幾種制備途徑,微生物表達(dá)體系具有成本低,周期短和表達(dá)量高等明顯優(yōu)勢(shì)。大腸桿菌(Escherichia coli)作為常用的微生物表達(dá)系統(tǒng)之一,因其具有操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵周期短等優(yōu)點(diǎn),是研究膠原蛋白表達(dá)及性質(zhì)的理想模式宿主。

釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)膠原蛋白是目前研究比較深入的細(xì)菌膠原蛋白,其序列中不含羥脯氨酸,無(wú)需進(jìn)行翻譯后修飾。BARBARA BRODSKY團(tuán)隊(duì)利用大腸桿菌異源表達(dá)釀膿鏈球菌膠原蛋白Scl2,并證明膠原樣區(qū)域能正確折疊,對(duì)成纖維細(xì)胞沒有毒性,不會(huì)引發(fā)SJL/J和Arc兩種小鼠細(xì)胞的免疫反應(yīng)[9-12]。此外,Scl2具有成為生物材料的潛力,例如通過(guò)戊二醛交聯(lián)的Scl2能夠形成穩(wěn)定的材料,支持細(xì)胞附著[9]；Scl2通過(guò)光交聯(lián)位點(diǎn)功能化并與聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEGDA)交聯(lián)形成水凝膠,可以作為控制細(xì)胞特異性粘附、增殖和分化的新型生物材料[13]。釀膿鏈球菌膠原蛋白Scl2的熱穩(wěn)定性約37 ℃,其穩(wěn)定性主要是通過(guò)帶電殘基之間的靜電相互作用[14-15]。高溫度(>37 ℃)或者高鹽環(huán)境會(huì)破壞Scl2膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),限制了其作為生物材料的體外應(yīng)用。

膠原蛋白單鏈由連續(xù)的Xaa-Yaa-Gly三聯(lián)體構(gòu)成,脯氨酸(Pro)通常出現(xiàn)在Xaa位置,羥脯氨酸(Hyp)在Yaa位置[16-17]。Gly的酰胺基團(tuán)上的氮與相鄰鏈X位的羰基氧能形成鏈間氫鍵,提高膠原蛋白的熱穩(wěn)定性,(POG)n和(PPG)n膠原肽具有較高的熱穩(wěn)定性,一直被用作研究膠原三股螺旋內(nèi)氨基酸相互作用力的模式序列[18-20]。本研究以來(lái)源于S.pyogenes的膠原蛋白Scl2的三股螺旋區(qū)域B為對(duì)象進(jìn)行序列設(shè)計(jì),在B序列不同位置嵌合不同長(zhǎng)度的高脯氨酸Pro-Pro-Gly序列,通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化提高膠原蛋白的表達(dá)量,并研究了高脯氨酸序列Pro-Pro-Gly嵌合的位置和長(zhǎng)度對(duì)膠原蛋白熱穩(wěn)定的影響,為設(shè)計(jì)提高重組膠原蛋白的熱穩(wěn)定性,拓展其應(yīng)用范圍提供了策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究中所使用的菌株、質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒

Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10,瓊脂粉15。

TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24,蛋白胨12,甘油4,K2HPO4 12.54,KH2PO4 2.31。

1.1.3 儀器

振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司；電子天平,Mettler Toledo儀器有限公司；瓊脂糖水平電泳儀,美國(guó)BIO-RAD公司；AKTATM pure蛋白純化儀,美國(guó)General Electric公司；基質(zhì)輔助激光飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,美國(guó)Bruker Daltonics公司；恒溫水浴鍋,上海東興建材試驗(yàn)設(shè)備有限公司；圓二色譜儀,英國(guó)Applied Photophysics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建

以化膿性鏈球菌膠原蛋白Scl2的序列為基礎(chǔ)(NCBI 序列號(hào)：AAL50184),截短其膠原三股螺旋區(qū)域序列并在序列中嵌合高脯氨酸含量的膠原序列(Pro-Pro-Gly)n(n為5,10或15),優(yōu)化(針對(duì)大腸桿菌)并合成基因(GENEWIZ,CHN),并添加5′Nco I和5′UTR([GC])和3′BamH I,然后克隆到pET28a載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中,用含50 μg/mL的卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,進(jìn)一步利用Nco I和BamH I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,得到陽(yáng)性克隆。

1.2.2 菌種培養(yǎng)方法

種子制備：將驗(yàn)證正確的重組基因工程菌劃線至帶卡那霉素抗性的LB平板,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),挑取單菌落轉(zhuǎn)接至20 mL LB液體培養(yǎng)基中活化,在37 ℃、200 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。

搖瓶發(fā)酵：按1%接種量將種子接種于帶卡那霉素抗性的TB培養(yǎng)基,于37 ℃下培養(yǎng)至誘導(dǎo)菌體濃度后,加入誘導(dǎo)劑,轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)溫度繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)于所產(chǎn)膠原蛋白熱穩(wěn)定較低的菌株,采用25 ℃誘導(dǎo),其他菌株均于最優(yōu)誘導(dǎo)溫度下誘導(dǎo)表達(dá)。

5 L發(fā)酵罐：按1%接種量將種子接種到3 L的TB培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng),菌株生長(zhǎng)中后期約3 h左右加入終濃度為1.0 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),35 ℃誘導(dǎo)表達(dá),并間隔時(shí)間取樣測(cè)定菌體濃度和蛋白表達(dá)量。

1.2.3 重組膠原蛋白工程菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將驗(yàn)證正確的基因工程重組菌株劃線至LB平板(含50 μg/mL卡那霉素),然后挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中(含50 μg/mL卡那霉素),每隔1 h取樣測(cè)定其菌體濃度,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

誘導(dǎo)菌體濃度優(yōu)化：將種子液以1%接種量接入含有卡那霉素(終質(zhì)量濃度50 μg/mL)的30 mL TB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng),在OD600約為0.6、1、2.5和4.5時(shí)加入IPTG(終濃度1 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo),于25 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h,測(cè)定菌液于600 nm的吸收值(OD600),同時(shí)收集1 mL菌體進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析膠原蛋白的蛋白表達(dá)情況。

誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)下,誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為25、30、35、40 ℃,發(fā)酵12 h。取1 mL樣品測(cè)定OD600及膠原蛋白表達(dá)量。

發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化：在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和溫度的條件下,分別在發(fā)酵1、2、4、8、12、24 h時(shí),取1 mL樣品測(cè)定OD600及膠原蛋白表達(dá)量。

誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化：在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、溫度和誘導(dǎo)時(shí)間下,分別以終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)12 h結(jié)束后,取1 mL樣品測(cè)定OD600及膠原蛋白表達(dá)量。

1.2.5 膠原蛋白的制備

發(fā)酵后的菌液于8 000 r/min離心5 min收集發(fā)酵液中菌體。然后重懸于結(jié)合緩沖液A(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、pH 7.4)中,隨后通過(guò)超聲波破碎儀破碎細(xì)胞,12 000 r/min離心20 min后,取上清液過(guò)0.22 μm濾膜。然后利用His TrapTM HP 5 mL柱進(jìn)行親和純化,利用結(jié)合緩沖液A平衡5個(gè)柱體積后,注入樣品,繼續(xù)用結(jié)合緩沖液A洗脫雜蛋白。然后用洗脫緩沖液B(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4和500 mmol/L NaCl,1 mol/L咪唑,pH 7.4)梯度洗脫,收集130、160和400 mmol/L咪唑濃度下的洗脫峰,透析脫鹽后,利用冷凍干燥機(jī)凍干樣品用于實(shí)驗(yàn)。通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白純度及MALDI-TOF-MS鑒定分子質(zhì)量。

1.2.6 圓二色譜

將凍干的膠原蛋白粉末(1 mg/mL)溶于pH 7.4的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中,然后在4 ℃放置24 h以上。全波長(zhǎng)掃描在4 ℃下進(jìn)行,波長(zhǎng)范圍為190～260 nm,每步間隔1 nm,平均停留時(shí)間為5 s。熱變實(shí)驗(yàn)在220 nm下進(jìn)行,在4～80 ℃溫度范圍內(nèi)升溫,升溫速率為10 ℃/h,每個(gè)溫度下平衡8 s。熔融溫度(Tm)通過(guò)擬合熱變曲線的一階導(dǎo)數(shù)求得。

1.2.7 分析方法

菌體濃度(OD600)測(cè)定：取菌液稀釋適當(dāng)倍數(shù),利用可見光分光光度計(jì)在600 nm下測(cè)量其吸收值。SDS-PAGE：取發(fā)酵后的菌液,將所有樣品OD600稀釋為5,取40 μL加入10 μL的5×蛋白上樣緩沖液(碧云天,中國(guó)),于100 ℃煮沸10 min后,10 000 r/min離心2 min,取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE(12%分離膠,5%濃縮膠)分析,具體操作均參考說(shuō)明書(BIO-RAD,美國(guó))。膠原蛋白表達(dá)量比較：利用凝膠成像儀(BIO-RAD,美國(guó))對(duì)SDS-PAGE電泳圖進(jìn)行觀察和拍照,利用ImageJ分析計(jì)算目的蛋白條帶的灰度值,與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(TaKaRa,日本)中條帶灰度值比較,計(jì)算不同發(fā)酵條件下的膠原蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列設(shè)計(jì)

本研究以來(lái)源于S.pyogenes的Scl2膠原蛋白序列為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì),序列包含三聚體球狀結(jié)構(gòu)域(V)、截短后的膠原域B和富含脯氨酸的(Pro-Pro-Gly)n序列(圖1-a),其中膠原域B是Scl2膠原結(jié)構(gòu)域(CL)中熱穩(wěn)定性最高的一段,命名為Sp2B[11]。為了研究富脯氨酸序列的嵌合位置和長(zhǎng)度對(duì)膠原蛋白穩(wěn)定性的影響,分別在膠原域B的N端、C端或中間嵌合(Pro-Pro-Gly)10序列,命名為P10N、P10C和P10M,以及在Sp2B的N和C端同時(shí)嵌合(Pro-Pro-Gly)n(n為5,10或15),得到膠原蛋白P5、P10及P15。在所設(shè)計(jì)序列N端嵌合His標(biāo)簽后連接至載體pET28a,并利用Nco I和BamH I雙酶切驗(yàn)證(圖1-b,以P10為例)。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3),得到7株產(chǎn)膠原蛋白的基因工程菌株。

a-富脯氨酸膠原蛋白的設(shè)計(jì)示意圖；b-重組質(zhì)粒pET28a-P10雙酶切驗(yàn)證:泳道1-重組質(zhì)粒pET28a-P10雙酶切結(jié)果;M-DNA標(biāo)準(zhǔn)品；c-重組工程菌膠原蛋白表達(dá)分析:1-E.coli BL21(DE3)/pET28a菌種全細(xì)胞蛋白;2-E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10菌株全細(xì)胞蛋白;M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品

圖1 序列設(shè)計(jì)示意圖、重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)鑒定圖

Fig.1 Sequence design diagram,recombinant plasmid construction and expression identification diagram

2.2 重組產(chǎn)膠原蛋白工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 重組產(chǎn)膠原蛋白工程菌的表達(dá)測(cè)試及生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10和未嵌合外源膠原蛋白基因的菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(陰性對(duì)照)進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證,如圖1-c所示,與陰性對(duì)照比較,發(fā)酵后的E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10全細(xì)胞經(jīng)SDS-PAGE分析,在目標(biāo)分子質(zhì)量附近出現(xiàn)目的條帶,表明基因工程重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10已成功構(gòu)建,重組膠原蛋白P10的產(chǎn)量約為30 mg/L。選取重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

細(xì)菌的生長(zhǎng)過(guò)程分4個(gè)時(shí)期,延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。其中對(duì)數(shù)期是細(xì)胞活性最強(qiáng)、比生長(zhǎng)速率最大的時(shí)期。為確定重組基因工程菌的對(duì)數(shù)期,取重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。結(jié)果如圖2所示,基因工程重組菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10在0～1 h期間處于延滯期,1 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期,OD600呈明顯的上升趨勢(shì),6 h后處于穩(wěn)定期。10 h后菌體的生長(zhǎng)速率開始下降。由此得出活化的菌株應(yīng)在2～6 h(OD600約為1～5)菌齡時(shí)接入TB培養(yǎng)基中,此時(shí)菌種生長(zhǎng)活力最好。

圖2 重組菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10搖瓶種子的生長(zhǎng)曲線

Fig.2 Growth curve of recombinant bacteria E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10

2.2.2 初始誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)膠原蛋白產(chǎn)量的影響

以1%接種量接入含有卡那霉素的30 mL TB培養(yǎng)基中,分別在指數(shù)生長(zhǎng)前期(OD600≈0.6)、中期(OD600≈1.0)、中后期(OD600≈2.5)和后期(OD600≈4.5)時(shí)加入1 mmol/L的IPTG,對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)時(shí)間為1.5、2、3、5 h,然后轉(zhuǎn)至25 ℃發(fā)酵24 h,結(jié)果如圖3所示。

泳道P10-重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10表達(dá)純化后的膠原蛋白P10(下同)

a-蛋白表達(dá)；b-菌體生長(zhǎng)

圖3 誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)蛋白表達(dá)和菌體生長(zhǎng)的影響

Fig.3 Effect of induction time point on protein expression and cell growth

利用ImageJ對(duì)SDS-PAGE中目的條帶進(jìn)行灰度分析,比較同OD600量細(xì)胞中膠原蛋白的量,在指數(shù)生長(zhǎng)前期(1.5 h)、中期(2 h)和中后期(3 h)誘導(dǎo)時(shí),膠原蛋白表達(dá)量相當(dāng),均為0.13 mg/mL左右,都高于指數(shù)生長(zhǎng)后期(5 h)的蛋白表達(dá)量(0.09 mg/mL)。但在指數(shù)生長(zhǎng)前期和中期誘導(dǎo)時(shí),最后收集得到的菌體量較少?？赡苁钦T導(dǎo)劑的添加時(shí)間過(guò)早會(huì)影響菌體的生長(zhǎng),而誘導(dǎo)劑添加過(guò)晚不利于蛋白的表達(dá)。綜合考慮,選擇在指數(shù)生長(zhǎng)中后期(3 h),OD600約為2.5左右時(shí)誘導(dǎo)。

2.2.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)膠原蛋白產(chǎn)量的影響

為了考察誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白產(chǎn)量的影響,以1%接種量接入含有卡那霉素的30 mL TB培養(yǎng)基中,在初始OD600值為2.5時(shí)加入1 mmol/L的IPTG,分別于25、30、35和40 ℃下誘導(dǎo)24 h。如圖4所示,誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和膠原蛋白表達(dá)影響顯著,隨著培養(yǎng)溫度的上升,誘導(dǎo)24 h后的OD600略微降低,但膠原蛋白表達(dá)量明顯升高,分別為0.04、0.08、0.15、0.14 mg/mL,確定最佳誘導(dǎo)溫度為35 ℃。

a-蛋白表達(dá)；b-菌體生長(zhǎng)

圖4 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)和菌體生長(zhǎng)的影響

Fig.4 Effect of induction temperature on protein expression and cell growth

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)膠原蛋白產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短能夠影響胞內(nèi)蛋白的富集量。以1%接種量接入含有卡那霉素的30 mL TB培養(yǎng)基中,在初始OD600值為2.5時(shí)加入1 mmol/L的IPTG,在發(fā)酵1、2、4、8、12、24 h后分別測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況和目的膠原蛋白的表達(dá)情況。如圖5所示,1～8 h,目的膠原蛋白P10表達(dá)量沒有明顯的提高,從0.03 mg/mL上升到0.06 mg/mL。12 h以后顯著提高(0.09 mg/mL),24 h時(shí)表達(dá)量最高,為0.12 mg/mL。結(jié)果表明,此蛋白在重組菌中的表達(dá)方式可能為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型,即生長(zhǎng)到穩(wěn)定期后再大量表達(dá)?？紤]到TB培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)有限以及發(fā)酵周期的延長(zhǎng),確定誘導(dǎo)后的發(fā)酵時(shí)間為24 h。

a-蛋白表達(dá)；b-菌體生長(zhǎng)

圖5 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)蛋白表達(dá)和菌體生長(zhǎng)的影響

Fig.5 Effect of induction time on protein expression and cell growth

2.2.5 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)膠原蛋白產(chǎn)量的影響

誘導(dǎo)劑IPTG濃度能夠顯著影響蛋白的表達(dá)水平,在前期研究中,IPTG的濃度為1.0 mmol/L。以1%接種量接入含有卡那霉素的30 mL TB培養(yǎng)基中,在初始OD600值為2.5時(shí),分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的IPTG,分別于35 ℃下誘導(dǎo)24 h。由圖6可知,誘導(dǎo)劑濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)顯著影響,在IPTG終濃度為1.0 mmol/L時(shí),重組膠原蛋白表達(dá)效果最好,確定最佳IPTG濃度為1.0 mmol/L,搖瓶?jī)?yōu)化后的產(chǎn)量約為110 mg/L。

a-蛋白表達(dá)；b-菌體生長(zhǎng)

圖6 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)蛋白表達(dá)和菌體生長(zhǎng)的影響

Fig.6 Effect of IPTG concentration on protein expression and cell growth

2.2.6 5 L發(fā)酵罐水平蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步提高目的膠原蛋白產(chǎn)量,將重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10在5 L的發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。如圖7所示,誘導(dǎo)12 h細(xì)胞密度最大,可能是發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足,菌體生長(zhǎng)提前到達(dá)衰亡期。利用ImageJ對(duì)SDS-PAGE中目的條帶灰度進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示,膠原蛋白的產(chǎn)量不斷積累。在添加誘導(dǎo)劑后的前8 h,菌體穩(wěn)定生長(zhǎng),膠原蛋白表達(dá)不明顯；8 h后,膠原蛋白表達(dá)量明顯增加；發(fā)酵12、18以及24 h時(shí),同OD600量的細(xì)胞產(chǎn)蛋白量無(wú)明顯差異(0.17 mg/mL),顯著高于前8 h的蛋白量(0.05～0.14 mg/mL)。12 h后膠原蛋白表達(dá)量無(wú)明顯增加,但發(fā)酵結(jié)束后收集得到的菌體量不斷減少,故選擇發(fā)酵時(shí)間為12 h。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的5 L發(fā)酵罐產(chǎn)量約為150 mg/L,約為搖瓶初始產(chǎn)量的5倍。

a-蛋白表達(dá)；b-菌體生長(zhǎng)

圖7 5 L發(fā)酵罐中蛋白表達(dá)和菌體生長(zhǎng)

Fig.7 The protein expression and cell growth on 5 L fermentor

2.3 重組富脯氨酸膠原蛋白的純化及鑒定

將發(fā)酵后的重組菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-P10全細(xì)胞利用超聲波破碎儀破壁后,離心收集上清液,利用序列N端的His標(biāo)簽進(jìn)行親和純化,收集洗脫蛋白,經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證(圖7和圖10-a),160和400 mmol/L咪唑洗脫峰均為目的蛋白洗脫峰,得到高純度的膠原蛋白P10。因?yàn)槟z原蛋白為棒狀結(jié)構(gòu),相比于蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的球狀蛋白,其遷移速度相對(duì)較慢[10]。為進(jìn)一步驗(yàn)證所制備得到的蛋白為目的膠原蛋白,利用MALDI-TOF-MS對(duì)其分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜結(jié)果顯示(圖8),P10膠原蛋白的分子質(zhì)量為22 859 Da,和理論相對(duì)分子質(zhì)量相吻合(Mw=22 843 Da),確定為目的膠原蛋白P10。

圖8 膠原蛋白P10的飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定

Fig.8 MALDI-TOF-MS of collagen protein P10

2.4 高脯氨酸序列位置對(duì)膠原蛋白熱穩(wěn)定性的影響

2.4.1 膠原蛋白的純化及鑒定

以截短的S.pyogenes Scl2膠原蛋白B區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)(Sp2B),分別構(gòu)建Sp2B、在Sp2B的N、C端或者中間嵌合(Pro-Pro-Gly)10短肽的P10N、P10C和P10M菌株,以上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),將超聲破壁后上清液過(guò)膜處理,利用N端的His標(biāo)簽進(jìn)行親和純化,純化方法同2.3,洗脫得到膠原蛋白Sp2B、P10N、P10C和P10M,經(jīng)SDS-PAGE分析,純度均大于95%(圖9-a)。

2.4.2 膠原蛋白的熱穩(wěn)定性

Sp2B由富含α-螺旋的球狀結(jié)構(gòu)域和三股螺旋的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域組成,α-螺旋在192和222 nm有負(fù)的特征吸收峰,典型的膠原三股螺旋在220 nm下有正的特征吸收峰。如圖9-b所示,Sp2B表現(xiàn)為α-螺旋和膠原蛋白三股螺旋的疊加譜圖,這與YU等[11]的研究一致。根據(jù)圖9-c熱變結(jié)果擬合出Sp2B的Tm為29 ℃,P10C和P10M的Tm值為40 ℃(表2),相比于未融合(Pro-Pro-Gly)10短肽的膠原蛋白Sp2B提高了11 ℃[11]。

表2 重組膠原蛋白熱穩(wěn)定性及理論分子質(zhì)量

Table 2 The stability and molecular weight of recombinant collagen

注：P15沒有折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu),無(wú)Tm值

a-純化后膠原蛋白的SDS-PAGE鑒定；b-全波長(zhǎng)譜圖；c-熱變曲線

圖9 不同位置嵌合富脯氨酸序列膠原蛋白的純化及圓二色譜圖

Fig.9 Purification and circular dichroism spectrum of collagen with proline rich sequence inserted at different sites

在膠原蛋白序列的N端嵌合(Pro-Pro-Gly)10短肽的P10N,其Tm為32.5 ℃,相比于在膠原序列的C端和中間嵌合(Pro-Pro-Gly)10短肽的熱穩(wěn)定性低,說(shuō)明在膠原區(qū)域的C端和中間嵌合(Pro-Pro-Gly)10短肽更利于熱穩(wěn)定性的提高。

2.5 高脯氨酸序列長(zhǎng)度對(duì)膠原蛋白熱穩(wěn)定性的影響

2.5.1 膠原蛋白的純化及鑒定

分別在Sp2B的N和C端嵌合(Pro-Pro-Gly)n(n為5、10或15)短肽,構(gòu)建P5、P10和P15菌株,以上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),將超聲破壁后上清過(guò)膜處理,利用N端的His標(biāo)簽進(jìn)行親和純化,純化方法同2.3,洗脫得到膠原蛋白P5、P10和P15,經(jīng)SDS-PAGE分析,純度均大于95%(圖10-a)。

2.5.2 膠原蛋白的熱穩(wěn)定性

圖10-b顯示,P5和P10的全波長(zhǎng)掃描譜圖也顯示為α-螺旋和膠原蛋白三股螺旋的疊加譜圖,而P15在220 nm左右的特征吸收峰相對(duì)較小,說(shuō)明三股螺旋成分降低。進(jìn)一步的熱變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖10-c和表1),P5和P10正確折疊形成了三股螺旋結(jié)構(gòu),而P15未能正確折疊。在球狀結(jié)構(gòu)域和膠原區(qū)域之間嵌合Pro-Pro-Gly短肽會(huì)影響膠原區(qū)域的折疊,嵌合(Pro-Pro-Gly)15會(huì)導(dǎo)致膠原區(qū)域無(wú)法正確折疊形成三股螺旋結(jié)構(gòu)。P5和P10的Tm值分別為45、52 ℃,相比于Sp2B提高約16、23 ℃,表明在膠原序列中嵌合一定長(zhǎng)度Pro-Pro-Gly短肽能夠有效提高膠原蛋白的熱穩(wěn)定性,但是當(dāng)Pro-Pro-Gly短肽重復(fù)過(guò)多時(shí),如P15,會(huì)導(dǎo)致膠原三股螺旋的錯(cuò)配而破壞膠原三股螺旋的正確折疊。

a-純化后膠原蛋白的SDS-PAGE鑒定；b-全波長(zhǎng)譜圖；c-熱變曲線

圖10 嵌合不同長(zhǎng)度富脯氨酸序列膠原蛋白的純化及圓二色譜圖

Fig.10 Purification and circular dichroism spectrum of collagen with different length proline rich sequence

3 結(jié)論

本研究在截短的天然細(xì)菌膠原蛋白中嵌合富脯氨酸的Pro-Pro-Gly短肽,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)重組菌株生長(zhǎng)和膠原蛋白表達(dá)的影響,確定了重組菌株搖瓶發(fā)酵的最佳條件：初始誘導(dǎo)菌體濃度OD600為2.5、發(fā)酵周期24 h、誘導(dǎo)劑終濃度1.0 mmol/L、誘導(dǎo)溫度35 ℃。并利用5 L發(fā)酵罐擴(kuò)大制備重組富脯氨酸膠原蛋白,產(chǎn)量約為150 mg/L,為搖瓶初始表達(dá)量的5倍。嵌合富氨基酸序列(Pro-Pro-Gly)n的位置對(duì)膠原蛋白的熱穩(wěn)定性有一定的影響,在膠原序列中間和C端嵌合(Pro-Pro-Gly)10更利于熱穩(wěn)定性的提高,相比于原始膠原蛋白Sp2B提高了11 ℃,在N端嵌合提高了3.5 ℃。富脯氨酸序列的長(zhǎng)度對(duì)熱穩(wěn)定性有較大的影響,與原始膠原蛋白Sp2B相比較,在N端和C端同時(shí)嵌合5和10個(gè)富脯氨酸序列Pro-Pro-Gly的膠原蛋白熱穩(wěn)定性分別提高了16、23 ℃,這對(duì)高熱穩(wěn)定性膠原蛋白材料的設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)。