磷脂酶D交聯聚集體的制備及其酶學性能研究

酶催化因其較高的催化活性、特異性和溫和的反應條件而被廣泛應用于醫(yī)藥、食品加工、化學合成和生物降解等領域。其中,磷脂酶D(EC 3.1.4.4 phospholipase D,PLD)可以催化水解磷脂分子并生成磷脂酸和有機堿。在一定條件下PLD還能夠催化甘油、絲氨酸、膽堿、醇類物質等含羥基的化合物與磷脂?；鶊F結合,形成新的磷脂[1-2]。PLD催化作用反應式如圖1所示。雖然PLD存在于各種微生物、植物、動物中,但來源于微生物的PLD具有對底物耐受性強、對堿基交換反應催化活性高的特點[3]。

圖1 PLD的催化水解和轉磷脂?；磻淖饔脵C理

Fig.1 Reaction mechanism of PLD-catalyzed hydrolysis and transphosphatidylation

天然PLD存在成本較高、操作穩(wěn)定性低、回收再利用困難等缺陷,嚴重制約了其在工業(yè)上的應用。酶固定化是解決上述問題的有效手段之一。近年來,關于PLD固定化的研究已有少量報道。MAO等[4]以環(huán)氧樹脂交聯法對Bacillus subtilis來源的PLD進行固定化,但所得固定化酶底物轉化率和重復使用性都較差。通過對載體進行改進,得到了以介孔SiO2/聚合物納米復合材料[5]、氨基功能化的中空介孔SiO2立方體[6]、分層空隙聚合物修飾的環(huán)氧樹脂[7]為載體的PLD固定化酶,具有良好的操作穩(wěn)定性,且材料新穎,但載體成本較高,難于進行大規(guī)模的工業(yè)化生產。上述PLD固定化酶中含有大量的非催化載體,降低了固定化酶的單位體積活性和催化效率,而且對于惰性基質需要對其進行化學修飾后,才能與PLD進行共價偶聯,制作成本較高[8-9]。因此,尋求一種操作簡單、成本經濟、酶活力回收率高且操作穩(wěn)定性良好的PLD固定化方法受到越來越多的關注。

交聯酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)是一種無載體固定化技術。首先通過水溶性有機溶劑、中性鹽溶液或非離子型聚合物等沉淀劑將游離酶沉淀,然后加入雙功能試劑交聯得到不溶于水的酶聚集體。由于酶的沉淀過程中存在的非共價作用力較弱,不會破壞蛋白質的三維結構,從而保留了酶的大部分活性[10-11]。與有載體固定化相比,CLEAs具有制備過程簡單、對酶純度要求低、單位體積活性高、特異性好、適用范圍廣泛等優(yōu)點,且具有優(yōu)異的有機溶劑和高溫高壓耐受性,表現出良好的貯藏穩(wěn)定性和實際操作穩(wěn)定性[10,12]。另外,CLEAs自身酶負載量高,在制備過程中活性損失較小,有效避免了固體載體引入時可能造成的酶失活[13]。近年來CLEAs技術已用于固定多種不同的酶,比如脂肪酶、漆酶、α-淀粉酶等,得到的CLEAs的穩(wěn)定性和催化性能都得到了不同程度的提高[14-16]。但目前尚未有利用CLEAs技術固定化PLD及其酶學性能研究的報道。因此,本研究擬開發(fā)一種高效的PLD-CLEAs的制備方法,并對所得固定化酶PLD-CLEAs的催化性能和酶學性質進行全面的評估。首先考察沉淀和交聯條件對酶活性回收率的影響,對PLD-CLEAs的酶學性質(催化活性、熱穩(wěn)定性、最適溫度和pH值、重復使用性)進行研究,并與游離酶進行探討和比較,以期得到一種高效的PLD固定化酶,為其工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)WB600,由本實驗室保藏。

試劑：膽堿氧化酶、過氧化物酶,Sigma-Aldrich；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、卡那霉素,北京索萊寶科技有限公司；卵磷脂(phosphatidylcholine,PC),上海源葉生物科技有限公司；硫酸銨、戊二醛、TritonX-100、MnCl2、NaCl,上海麥克林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、NaOH,北京奧博星生物技術有限責任公司公司；乙腈、乙醇、乙醚、鹽酸,賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 儀器與設備

SYC-A水浴恒溫振蕩器,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Centrifuge 5418小型高速離心機、Heto Drywinner冷凍干燥機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；ZXGP-B2080臺式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造有限公司；Multiskan Spectrum酶標儀、FEI Apreo掃描電子顯微鏡美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PLD的制備

取1 μL保藏于本實驗室-80 ℃冰箱的枯草芽胞桿菌,采用分段劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基上,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h,獲得單菌落。將單菌落轉移至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(5 mL),置于恒溫空氣浴搖床中37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h；取5 mL菌液轉接入含有50 μg/mL卡那霉素的250 mL培養(yǎng)液中,37 ℃,220 r/min培養(yǎng)48 h后,將發(fā)酵液在10 000 r/min、4 ℃離心10 min,上清液即為PLD粗酶液,凍干后備用。

1.3.2 PLD-CLEAs的制備及優(yōu)化

1.3.2.1 沉淀劑種類和濃度對PLD-CLEAs酶活性的影響

以PLD-CLEAs的酶活性回收率作為優(yōu)化指標,探討不同沉淀劑種類和濃度對PLD活性的影響。取1 mL 100 mg/mL的游離PLD酶液,分別加入到4 mL不同體積分數的預冷有機溶劑(乙醇和乙腈)和不同飽和度硫酸銨溶液中,PLD的質量濃度為100 mg/mL,4 ℃攪拌沉淀30 min。離心分離除去上清液,將沉淀用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)復溶后測定PLD的活性。

1.3.2.2 交聯劑濃度對PLD-CLEAs酶活性的影響

以PLD-CLEAs的酶活性回收率作為優(yōu)化指標,探討不同戊二醛濃度對PLD-CLEAs活性的影響。取1 mL 100 mg/mL的游離PLD酶液,與4 mL硫酸銨溶液混合,硫酸銨飽和度為60%,于4 ℃攪拌沉淀30 min。隨后分別加入不同質量分數的戊二醛(0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150%),在4 ℃下攪拌交聯1 h。反應結束后8 000 r/min離心分離5 min,收集沉淀物,用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)反復洗滌,獲得PLD-CLEAs并測定其活性。

1.3.2.3 交聯時間對PLD-CLEAs酶活性的影響

以PLD-CLEAs的酶活性回收率作為優(yōu)化指標，探討不同交聯時間對PLD-CLEAs活性的影響。取適量凍干的PLD酶粉，與4 mL硫酸銨溶液(飽和度60%)混合，PLD的質量濃度為100 mg/mL，于4 ℃攪拌沉淀30 min。隨后加入質量分數為0.125%的戊二醛，在4 ℃下分別攪拌反應0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。反應結束后，離心分離收集沉淀物，用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)反復洗滌，獲得PLD-CLEAs并測定其活性。

1.3.3 酶活力測定

PLD活性的測定參照HUANG等[17]的方法稍作改進。以PC為底物,將一定量的PLD加入到含有0.23 mol/L MnCl2的Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L,pH 8.0)中與底物溶液(4 mg/mL PC,乙醚8%,0.9 mol/L TritonX-100)充分混合,在45 ℃、200 r/min反應45 min后,煮沸5 min終止反應。反應液于室溫條件下冷卻后,取300 μL與500 μL膽堿顯色液(膽堿氧化酶0.5 U/mL,過氧化物酶1 U/mL,4-安替比林0.5 mg/mL,苯酚0.25 mg/mL)混合,37 ℃保溫30 min進行顯色,使用酶標儀測定反應產物在500 nm處的吸光值。根據氯化膽堿顯色后在500 nm處的標準曲線計算反應體系中膽堿的物質的量。一個酶活力單位(U)定義為:測試條件下1 min水解PC釋放1 μmol膽堿所需的PLD的量。

固定化酶活性回收率計算如公式(1)所示：

酶活性回收率

(1)

1.3.4 PLD-CLEAs的酶學性質

1.3.4.1 熱穩(wěn)定性

首先測定了不同酶制劑在高溫(50 ℃)下的熱穩(wěn)定性。用Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L,pH 8.0)配制相同濃度的游離和固定化酶溶液,將酶溶液置于50 ℃恒溫水浴振蕩器中保溫,200 r/min熱處理不同時間(0.5～6 h),按照1.3.3的方法測定每個時間點的酶活性。以酶液0 h時的催化活性為標準,將其活性定義為100%。

1.3.4.2 最適溫度的測定

通過在不同溫度條件下測定酶活力,確定固定化酶的最適反應溫度。將游離和固定化酶溶液分別置于25、35、45、55、65 ℃下進行反應,不改變測定酶活力其他條件,對PLD和PLD-CLEAs的酶活力進行測定。

1.3.4.3 最適pH的測定

將游離和固定化酶溶液置于不同pH的緩沖溶液體系(100 mmol/L,pH 5.0～10.0)中,底物溶液pH也對應相應的反應pH值,對PLD和PLD-CLEAs的酶活力進行測定。所使用的緩沖溶液分別是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.0～6.0)、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 7.0～8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)和甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 10.0)。

1.3.4.4 固定化酶重復使用性研究

配制一定濃度的固定化酶溶液,在最適反應條件下以PC為底物測定其在500 nm處的吸光值,計算PLD-CLEAs的活性。將反應溶液離心分離去上清液,用100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)反復洗滌,以除去未反應的底物和產物；隨后將離心洗滌后的固定化酶重新分散于緩沖液中,加入新的底物進行下一次的反應,如此重復10次。連續(xù)測定固定化酶在循環(huán)多次后的剩余酶活力,第1次使用時的酶活力定義為100%。

2 結果與分析

2.1 PLD游離酶的制備

PLD粗酶液的SDS-PAGE分析如圖2所示,在分子質量約為60 kDa處,觀察到明顯的蛋白條帶,即為目的蛋白PLD。

M-蛋白質標準；1-PLD發(fā)酵上清液

圖2 PLD的SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of the phospholipase D

2.2 PLD-CLEAs的制備與優(yōu)化

CLEAs的制備主要包括酶分子的沉淀和酶聚集體的交聯,首先將溶解狀態(tài)的酶利用沉淀劑進行物理沉淀形成酶聚集體,再加入交聯劑使之與酶發(fā)生交聯反應形成不溶的CLEAs。其中沉淀劑的種類和濃度、交聯劑的濃度和交聯反應時間均對CLEAs的制備和酶學特性有重要影響。

沉淀是制備CLEAs的第1步。常用的沉淀劑主要包括非離子型聚合物、水溶性有機溶劑和中性鹽。為考察沉淀劑種類和濃度對酶沉淀過程中活性的影響,分別采用不同濃度的乙腈、乙醇、硫酸銨作為沉淀劑對PLD進行沉淀實驗,隨后用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)對所得聚集體進行復溶,測定溶解后的酶活力,并以未處理的PLD的酶活力為100%進行計算,結果如圖3。隨著沉淀劑濃度的增加,復溶后聚集體的酶活力回收呈現先升高后降低的趨勢,但峰值出現的階段有所變化。對于乙腈和乙醇,分別在體積分數60%和70%時的酶活力回收率最高,為40.6%和59.2%。但所有濃度條件下的酶活力均低于初始酶活力的60%。酶的失活可能是由于有機溶劑與酶的非極性殘基之間的疏水相互作用而引起的構象變化所導致的[18]。當硫酸銨飽和度為60%～80%時,其酶活力均高于PLD的初始酶活力,且濃度為60%時,酶活力回收率達到最大值,為132.5%。研究表明,當硫酸銨飽和度較高(≥60%)時,會誘導酶分子形成一種高活化構象,使酶分子獲得較高的活性,這種變化稱為超活化[19-20]。因此,選取飽和度為60%的硫酸銨作為沉淀劑。

圖3 沉淀劑的種類和濃度對PLD-CLEAs酶活力回收率的影響

Fig.3 Effects of precipitants type and concentration on PLD-CLEAs activity recovery

戊二醛是CLEAs制備過程中最常用的雙功能交聯試劑。利用戊二醛作為交聯劑,并探索不同濃度的戊二醛對PLD-CLEAs活性回收率的影響,結果如圖4。

圖4 戊二醛濃度對PLD-CLEAs酶活力回收率的影響

Fig.4 Effects of glutaraldehyde concentration on PLD-CLEAs activity recovery

由圖4可知,戊二醛濃度較低時,酶活力回收率較低,主要是因為低濃度的戊二醛和酶之間的交聯不充分,所得交聯聚集體的酶損失較多；當戊二醛質量分數增加到0.125%時,PLD-CLEAs的酶活力回收率最高,但進一步提高戊二醛濃度后,酶活力回收率開始下降,可能是因為較小體積的戊二醛進入到酶分子內部并使其發(fā)生分子內交聯,造成酶活性的損失[21]；且高交聯劑濃度下得到的大粒徑CLEAs會影響酶與底物的結合,從而降低了酶催化速率[22]。因此,選取質量分數為0.125%的戊二醛為交聯劑。

交聯時間是制備CLEAs的重要影響因素之一。圖5為不同交聯時間對PLD-CLEAs酶活力回收率的影響。在實驗時間范圍(0.5～3 h)內,PLD-CLEAs的酶活力回收率隨交聯時間的延長先升高后降低,在1.5 h時達到最高值。在交聯前期,隨著時間的延長酶聚集體增多,得到的固定化酶的酶活力提高；交聯時間超過1.5 h后,過多的酶聚集在一起,導致PLD-CLEAs空間位阻變大,且由于大量酶活性位點被包埋在聚集體內部而阻礙了酶與底物的接觸,造成酶活力回收率下降。因此,制備PLD-CLEAs的最佳交聯時間是1.5 h。

圖5 交聯時間對PLD-CLEAs酶活力回收率的影響

Fig.5 Effects of cross-linking time on PLD-CLEAs activity recovery

通過對PLD-CLEAs制備過程中的影響因素分析表明,以60%的硫酸銨溶液作為沉淀劑沉淀30 min后,加入0.125%的戊二醛交聯1.5 h,PLD-CLEAs的酶活力回收率最高,為118.8%。這可能是由于酶分子經60%硫酸銨誘導所形成的超活化結構,通過戊二醛交聯,成功地將高活性的酶構象保留了下來。

2.3 PLD-CLEAs的特性分析

2.3.1 最適催化溫度

反應溫度對PLD和PLD-CLEAs活性的影響見圖6。在25～45 ℃,游離與固定化酶的活性均隨溫度的升高而增大,在45 ℃時兩者的酶活性均達到最高值,且在相同反應溫度下PLD-CLEAs的酶活力較高。當溫度>45 ℃時,游離PLD的活性迅速下降,在65 ℃時的活性回收率僅為47.8%,而PLD-CLEAs在65 ℃時仍具有70.2%的酶活力。相較于游離酶,固定化酶提高了在較高溫度下的反應活性,可能是由于戊二醛與酶分子之間的共價結合,提高了酶的剛性和構象穩(wěn)定性,防止酶的構象轉變并保護酶結構不被破壞,從而增強了酶抵抗外界條件的能力[23]。

圖6 反應溫度對游離PLD和PLD-CLEAs活性的影響

Fig.6 Effect of temperature on the activities of free PLD and PLD-CLEAs

2.3.2 最適催化pH

酶的固定化通常會導致酶構象的變化,最適催化pH也會隨之發(fā)生變化。反應pH對游離PLD和PLD-CLEAs活性的影響見圖7,游離PLD的最適反應pH值為8.0,交聯后的PLD-CLEAs的最適pH是7.0。在pH 5.0～9.0 PLD-CLEAs的酶活力均高于游離酶,說明PLD的交聯固定化有利于穩(wěn)定酶的結構[24]；而當pH≥9.0時,游離酶的表現更好。表明得到的PLD-CLEAs在低pH條件下比游離酶的耐受性更好,拓寬了PLD的pH應用范圍。

圖7 反應pH對游離PLD和PLD-CLEAs活性的影響

Fig.7 Effect of pH on the activities of free PLD and PLD-CLEAs

2.3.3 熱穩(wěn)定性

為了更好地了解CLEAs對PLD熱穩(wěn)定性的影響,將游離PLD和PLD-CLEAs在50 ℃下保溫不同時間(0～6 h)后,測定他們的剩余酶活力,結果如圖8。隨著保溫時間的延長,游離PLD和PLD-CLEAs的活性逐漸降低,但PLD-CLEAs的下降速率明顯小于游離酶的降低速率。保溫2.5 h時,游離酶的活性僅為初始活性的51.3%,而PLD-CLEA仍保留78.6%的初始活性；當保溫6 h后,PLD-CLEA的酶活力回收率高達52.2%,游離PLD已基本失活。表明PLD經戊二醛交聯后,PLD-CLEA的抗熱應力能力明顯提高,這主要是因為酶分子間發(fā)生交聯之后,酶分子間的多位點的共價結合增強了酶的剛性,防止酶的構象轉變并保護酶結構不被破壞,使其發(fā)生構象變化和展開的可能性變小,因而提高了其在高溫條件下的穩(wěn)定性[25]。

圖8 游離PLD和PLD-CLEAs的熱穩(wěn)定性

Fig.8 Thermal stability of free PLD and PLD-CLEAs

2.3.4 固定化酶重復使用性

重復使用性是衡量固定化酶性能優(yōu)劣的關鍵因素。以PC為底物,考察了PLD-CLEAs在連續(xù)使用10次后酶活力回收率的變化,結果見圖9。

圖9 固定化酶PLD-CLEAs的重復使用性

Fig.9 Reusability of PLD-CLEAs

由圖9可知,隨著使用次數的增加,PLD-CLEAs的酶活力回收率逐漸降低,在前7次的使用過程中,其酶活力降低較快,可能是由于CLEAs中的部分酶分子間沒有充分交聯,只是吸附在酶聚集體的表面,在反復洗滌和離心回收的過程中發(fā)生酶的脫落,導致酶活性降低[26]；隨著使用次數的增加,酶活力仍在下降,但下降速率減慢,這可能是由于酶在催化過程中的失活和離心過程中的機械損傷或損失造成的[20]。在重復使用10次后,剩余酶活性仍然保留了初始酶活力的50.4%,表現出良好的重復使用性。LI等[27]將生物印跡法活化后的PLD進行交聯固定化后所得固定化酶重復使用10次后,活性僅保留初始活性的21.8%。因此,PLD-CLEAs不僅具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性,且具有良好的重復使用性。這些優(yōu)異的特性使PLD-CLEAs成為一種非常有潛力的生物催化劑。

3 結論

本文采用CLEAs技術對PLD進行固定化,得到PLD-CLEAs。在硫酸銨飽和度為60%,戊二醛質量分數為0.125%,交聯1.5 h時,PLD-CLEAs的最大酶活力回收率為118.8%。PLD-CLEAs對pH和溫度的穩(wěn)定性明顯高于游離酶,且PLD-CLEAs具有良好的重復使用性。在重復使用10次后,PLD-CLEAs還能保持50%以上的酶活性。所制備的PLD-CLEAs在醫(yī)藥、化工等行業(yè)的具體應用需要進一步的研究,但其簡單的制備、高效的回收、優(yōu)異的催化性能和穩(wěn)定的操作性都說明,PLD-CLEAs的性能優(yōu)于游離酶,這使其在生物催化工業(yè)上有更大的應用潛力。