提取方法對(duì)真菌多糖得率及結(jié)構(gòu)特征影響研究進(jìn)展

早在三千多年前,我國(guó)就有栽培菌菇并作為食用菌的記載。食用菌類一般為高等真菌的子實(shí)體,在我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的品種至少有350 種,常見的食用菌類型有蘑菇、草菇、香菇、靈芝、金針菇、黑木耳、松口蘑等。其中部分可作藥用,如具有補(bǔ)中、固腎、益脾、補(bǔ)肺、止血作用的靈芝,滋陰、補(bǔ)腎、潤(rùn)肺、強(qiáng)精、補(bǔ)血提神的銀耳,對(duì)消化道腫瘤有較好療效、可治療神經(jīng)衰弱、消化不良等慢性疾病的猴頭菇,止血外敷藥的馬勃等。國(guó)際上多糖被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物”(biological reaction modulator,BRM),作為食用菌一種重要的生理活性物質(zhì),食用菌多糖具有可提高人體免疫力、治療腫瘤、哮喘和糖尿病等疾病等藥用功效,可作為機(jī)體免疫的增強(qiáng)和激活劑,在臨床治療中已有廣泛運(yùn)用[1]。目前學(xué)者對(duì)食用菌多糖進(jìn)行的熱點(diǎn)研究集中于真菌多糖的提取效率和得率的提高,多糖結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量和生物活性等。提取工藝作為食用菌多糖研究的首要前處理環(huán)節(jié),除了獲得高得率的多糖外,往往對(duì)獲得多糖結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生重要的影響。因此本文對(duì)目前研究較常使用的食用菌多糖提取方式、得率和對(duì)應(yīng)多糖結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行概括和綜述,為將來多糖構(gòu)效關(guān)系的研究提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 食用菌多糖現(xiàn)代提取工藝

常用真菌多糖提取方法有熱水提取法、酶提取法、超聲輔助提取法、堿提取法等,多糖的提取率及結(jié)構(gòu)的差異受提取溫度、料液比、提取功率、提取次數(shù)等因素的影響。食用真菌多糖的提取方法和步驟與其他植物多糖相似,其工藝流程大致為：食用菌子實(shí)體→粉碎→加水浸提→過濾→蒸發(fā)濃縮→除蛋白→沉淀→離心→干燥→食用菌多糖。為了提高效率和提取率,科研工作者往往也使用一些其他方法進(jìn)行輔助水浸提法,如：超聲-微波協(xié)同法、超聲波酶法、微波協(xié)同酶法。

1.1 超聲-微波協(xié)同法

超聲-微波協(xié)同提取法可克服單一超聲波或微波提取處理的缺陷,如單一超聲波法提取平均回收率較低,單一微波提取法易受溶劑特性影響、樣品量大時(shí)溫度分布不均等。超聲-微波協(xié)同提取法與傳統(tǒng)的微波和超聲波提取相比更安全,并且具有檢測(cè)樣品量大、受溶劑影響小等優(yōu)點(diǎn)。2種方法協(xié)同使用,可利用微波產(chǎn)生的能量和超聲波對(duì)細(xì)胞的破壞能力加速有效成分的溶出,來減少萃取時(shí)間以及降低能耗。超聲-微波協(xié)同法提取靈芝多糖比熱水法減少了3/4的提取時(shí)間、效率可提高26.27%,提取率是熱水提取的2倍,應(yīng)用于水溶性膳食纖維的提取時(shí),與傳統(tǒng)酶法提取相比得率可提高46.88%[2]。

1.2 超聲波酶法

超聲波酶法是利用超聲波將提取原料的細(xì)胞壁震碎破壞,擴(kuò)大可溶性物質(zhì)透過細(xì)胞多孔透析膜的通量,并協(xié)助酶更好地降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì),如蛋白酶可破壞肽鍵,水解蛋白質(zhì)；纖維素酶可以降解細(xì)胞中的纖維素,進(jìn)而提取出更多的多糖并提高多糖提取率。超聲波酶法提取粗提取物中的多糖含量比超聲法提取多糖高20%以上,如超聲波酶法提取靈芝多糖,粗提取物中的多糖含量達(dá)到57.62%,是超聲波法提取多糖的1.8倍[3]。

1.3 微波協(xié)同酶法

微波輻射是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達(dá)物料細(xì)胞后,細(xì)胞吸收微波能后溫度上升而產(chǎn)生內(nèi)外壓力的過程,壓力使植物細(xì)胞膨脹破碎進(jìn)而釋放功能性成分。微波結(jié)合酶法是利用微波具有的加熱高效性和酶對(duì)植物細(xì)胞組織間質(zhì)中的胞間結(jié)構(gòu)的破壞,使細(xì)胞破碎率進(jìn)一步升高,同時(shí)水分子在微波場(chǎng)下高速轉(zhuǎn)動(dòng)形成激發(fā)態(tài),并釋放出能量傳遞給其他物質(zhì)分子,促進(jìn)了溶劑分子熱運(yùn)動(dòng)加快,縮短萃取時(shí)間、降低萃取溫度,溶出更多的多糖。因微波結(jié)合酶法具有高效性、操作簡(jiǎn)便、得率高、產(chǎn)物易于純化等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取,如微波協(xié)同酶法相比單一酶法提取的金針菇多糖得率可由17.26%提高至21.76%[4]。

1.4 超高壓提取法

超高壓提取全稱為超高冷等靜壓提取,是指采用50～1 000 MPa的流體靜壓力處理目標(biāo)物質(zhì)。在超高壓提取的升壓過程中,溶劑通過滲透作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,在此過程中細(xì)胞的結(jié)構(gòu)在超高壓下受到不同程度的破壞。在保壓時(shí),細(xì)胞內(nèi)容物與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的溶劑接觸并溶于溶劑中；而在泄壓后細(xì)胞外部的壓力減小至零,由于反向高滲透壓差作用導(dǎo)致有效成分溶出,達(dá)到提取的目的,是一種非熱力學(xué)提取法。CHEN等[5]運(yùn)用超高壓技術(shù)提取蟲草多糖,多糖得率在300～400 MPa時(shí)迅速增加,在時(shí)間不變的情況下,多糖提取率隨溫度和壓力的升高而增加。超高壓過程中,細(xì)胞膜內(nèi)外的壓差很大,更多的溶劑進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞壁在較高壓力下容易破壞和溶解,誘導(dǎo)更多化合物滲透至細(xì)胞膜中。高壓破壞了蛋白質(zhì)和糖之間的鍵,使膳食纖維溶于提取液中,從而增加了葡聚糖含量。另一方面,高靜水壓結(jié)合熱水法提取可保護(hù)β-糖苷鍵不被破壞,較大程度地保留了多糖的生物活性。

不同提取方法會(huì)影響多糖的結(jié)構(gòu),如熱水提取的靈芝子實(shí)體多糖主要以β-(1→3)、(1→4)、(1→6)糖苷鍵為主鏈的葡聚糖構(gòu)成,而堿提法獲得的多糖則以β-(1→3)糖苷鍵連接,具有前者結(jié)構(gòu)的多糖具有較高抗氧化活性,而后者則有較強(qiáng)抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用[6]。此外提取方式對(duì)多糖中醛酸含量有重要影響,熱水和超聲提取靈芝多糖的醛酸含量分別約為9.89%和14.41%,后者具有較高的抗氧化活性[7]。目前的研究大多對(duì)一種食用真菌的不同提取方法進(jìn)行對(duì)比,缺少系統(tǒng)性的概括,本文將不同提取方法和不同品種食用真菌間的多糖得率和結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸納總結(jié),便于篩選各食用真菌多糖的較優(yōu)提取方法和結(jié)構(gòu)特征,為食用真菌多糖深加工提供指導(dǎo)。

2 不同提取方法對(duì)多糖得率和結(jié)構(gòu)的影響

2.1 靈芝多糖

靈芝多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、木糖和阿拉伯糖組成,其具有分子質(zhì)量和分支程度較高的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及不同的組分,包括β-葡聚糖、雜β-葡聚糖、雜聚糖或α-甘露聚糖、β-葡聚糖組成的復(fù)合物。同型葡聚糖是由α-或β-連接的葡萄糖單元組成的主鏈為直鏈或支鏈聚合物,如(1→3)、(1→6)-β-葡聚糖和α-(1→3)-葡聚糖,可以以非支鏈β-(1→3)-連接主鏈或具有β-(1→6)分支的β-(1→3)連接主鏈；雜葡聚糖側(cè)鏈包含葡糖醛酸、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖或核糖作為主要成分或以不同形式組合。其他聚糖通常在主鏈中含有除葡萄糖以外的單元,根據(jù)主鏈的單糖組成可分為半乳聚糖、巖藻聚糖、木聚糖和甘露聚糖。雜聚糖側(cè)鏈包含阿拉伯糖、甘露糖、巖藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸,它們以不同組合的形式存在。熱水提取的靈芝子實(shí)體多糖結(jié)構(gòu)為以β-糖苷鍵連接的雜聚糖,其中菌絲體多糖則是以α-D-(1→6)葡萄糖、α-D-葡萄糖、α-D-甘露糖為主鏈的雜多糖,單糖組成為葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖。子實(shí)體則由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、木糖、果糖構(gòu)成。不同的提取方法對(duì)靈芝子實(shí)體的多糖組成也有差異,超聲提取下的靈芝子實(shí)體多糖并未發(fā)現(xiàn)木糖和果糖,但存在巖藻糖。如表1所示,靈芝多糖的超聲法提取得率比熱水法更低,可能由于該多糖受提取溫度影響大于超聲波功率[8],同時(shí)超聲提取時(shí)靈芝多糖更易被破壞降解,導(dǎo)致分子質(zhì)量降低[7]。

表1 不同提取方法對(duì)靈芝多糖得率以及結(jié)構(gòu)的影響

Table 1 Effects of different extraction methods on the yield and structure of Ganoderma lucidum polysaccharides

微波功率和提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖得率影響較大,一般微波功率越大,提取時(shí)間越短產(chǎn)率越高,但熱穩(wěn)定性化合物可能受高功率微波的影響發(fā)生分解而降低了萃取效率。酶法提取靈芝多糖效果相對(duì)較好,不同種類的酶復(fù)配及用量、酶解條件等對(duì)得率有很大影響。木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶都對(duì)靈芝粗多糖的提取效果較好,這可能是由于這些酶促進(jìn)了細(xì)胞壁中果膠、纖維素等物質(zhì)的溶解,并導(dǎo)致多糖的溶出[9-10]。

2.2 蟲草多糖

蟲草是一種稀有食品,目前已分離出4種天然蟲草多糖,第1種天然蟲草多糖為葡聚糖,主鏈重復(fù)的骨架大多數(shù)是以α-(1→4)鍵連接的葡萄糖,分支點(diǎn)主要位于C6位,此外還含有(1→3)糖苷鍵連接的半乳糖和(1→2)鍵連接的甘露糖殘基,以及少量(1→6)和(1→4,6)連接的甘露糖殘基,端基為葡萄糖；第2種多糖主要為α-(1→2)-連接的甘露糖,分支點(diǎn)位于甘露糖殘基,支鏈部分由(1→3),(1→5),(1→4),(1→6)-半乳糖殘基組成,非還原端為半乳糖和甘露糖；第3、4種都通過堿法提取的,第3種為甘露聚糖,主鏈部分是以α-(1→6)-甘露糖殘基線性連接,在O-2和O-4位有分支,其中O-2與α-(1→2)-甘露糖殘基或半乳呋喃糖鏈相連,O-4與半乳呋喃糖鏈相連,分支的半乳糖鏈由β-(1→5)-半乳糖和β-(1→6)-半乳糖交替連接或以β-(1→6)-半乳糖殘基連接至甘露糖殘基的O-2和O-4位,端基為半乳糖；第4種是一種β-(1→3)-葡聚糖,在葡萄糖的C-6位置分支,端基為葡萄糖。在天然蟲草子實(shí)體中提取得到的3種多糖主鏈均為α-1,4-葡萄糖,單糖組成以葡萄糖為主,并含有少量半乳糖和甘露糖。而菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,主要以1,4-葡萄糖和1,4-半乳糖為主鏈,由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成,以及少量的阿拉伯糖和半乳糖酸。

使用熱水法提取蟲草多糖過程中若熱水溫度>70 ℃、時(shí)間>40 min會(huì)造成多糖水解并降低得率。與熱水提取法相比,微波與超聲法的多糖得率較高,但應(yīng)注意控制浸提時(shí)間和超聲功率[14]。超聲法利用空化作用使細(xì)胞破裂,但超聲波空穴作用會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的剪切力,而當(dāng)超聲功率>105 W、超聲時(shí)間>40 min時(shí)會(huì)嚴(yán)重破壞蟲草多糖的結(jié)構(gòu),并使其他雜質(zhì)溶出而導(dǎo)致多糖得率下降[15]；而微波輻射能直接穿透真菌細(xì)胞介質(zhì),由于極性物質(zhì)在微波輻射過程中的強(qiáng)吸收作用,使多糖分子偶極矩發(fā)生變化并產(chǎn)生分子振動(dòng),從而加熱物料使得細(xì)胞內(nèi)部的水分氣化,產(chǎn)生的壓力能使真菌細(xì)胞壁破損,從而釋放真菌細(xì)胞中的多糖[16]。使用酶提取法提取蟲草多糖是利用酶使組織細(xì)胞壁以及壁上的纖維素等物質(zhì)酶解提高得率,酸性蛋白酶效果優(yōu)于堿性蛋白酶,這可能由于在酸性條件下對(duì)蟲草細(xì)胞破壞更大所導(dǎo)致[17]。

冷熱水、微波、超聲、酶解提取蟲草(菌絲體)多糖后對(duì)多糖的糖苷鍵和糖環(huán)的類別沒有顯著影響,其中微波和熱水提取法的多糖得率較高,但提取率為酶解和微波法較高,冷熱水的提取率較低；如表2所示,5種提取方法提取的蟲草多糖分子質(zhì)量分布于4.2～2 940 kDa,分子質(zhì)量分布主要集中于極高分子質(zhì)量的多糖中(2 414～2 940 kDa),分子質(zhì)量大小為：微波>熱水>超聲>酶解>冷水,輔助提取后半乳糖和甘露糖的占比也隨之升高,酶法提取最高；黏度大小為：酶解>微波>熱水>超聲>冷水,以上結(jié)果表明通過加熱、微波等輔助手段的提取方式可能更容易破壞蟲草組織細(xì)胞結(jié)構(gòu),促進(jìn)高分子質(zhì)量多糖的溶出,進(jìn)而影響多糖組分分布；其中微波、熱水和酶解處理可能會(huì)使蟲草多糖的多螺旋結(jié)構(gòu)向單螺旋或片狀轉(zhuǎn)變,而超聲使其向介于螺旋形和片狀之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,總體而言對(duì)多糖結(jié)構(gòu)影響較小[18]。

表2 不同提取方法對(duì)蟲草多糖得率以及結(jié)構(gòu)的影響

Table2 Effects of different extraction methods on yield and structure of Cordyceps sinensis polysaccharides

續(xù)表2

2.3 銀耳多糖

多糖的主要結(jié)構(gòu)由單糖殘基的位置和序列、糖苷鍵的位置和手性決定,這些因素導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)具有多樣性。銀耳多糖的主要結(jié)構(gòu)以α-D-甘露糖為主鏈,其中甘露糖C-2連接有β-D-木糖、β-D-葡萄糖醛酸和β-D-木二糖,該鏈具有左旋三螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu),此外連接有6個(gè)甘露糖殘基組成的支鏈；還有研究發(fā)現(xiàn)其多糖鏈?zhǔn)怯?1→3)連接的葡聚糖和(1→2)或(1→4)為主要糖苷鍵連接的甘露糖。銀耳子實(shí)體和菌絲體多糖在單糖組成上存在細(xì)微差別,銀耳子實(shí)體是以甘露糖為主鏈且有多個(gè)分支的酸性雜多糖,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和巖藻糖組成；菌絲體多糖則是由α-(1→3)-D-甘露糖為主鏈,C2位上連有β-D-葡萄糖醛酸和β-(1→2)-D-木糖殘基,單糖組成為甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖的吡喃型多糖。

超聲提取的銀耳多糖不含還原糖、淀粉型多糖和蛋白質(zhì),部分組分含有糖醛酸[20]；多糖的得率受提取次數(shù)影響較大,超聲處理時(shí)間過長(zhǎng)很容易使銀耳多糖結(jié)構(gòu)破壞,提取次數(shù)超過2次之后得率即開始下降[21],這可能是由于超聲的空化作用導(dǎo)致多糖分子質(zhì)量降低。與熱水浸提法相比,超聲提取后銀耳多糖的單糖組成缺少巖藻糖且葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹行云咸烟?可能是由于超聲空化導(dǎo)致多糖糖苷鍵斷裂,進(jìn)而產(chǎn)生小分子質(zhì)量多糖所致[22]。

高溫高壓法提取多糖時(shí),100 ℃的高溫有利于多糖的浸出,在2 h后趨于平緩,如表3所示,高溫高壓輔助提取銀耳多糖的效果優(yōu)于超聲波處理效果[21]。堿和酶法也可用于銀耳多糖的提取,多糖得率與堿濃度呈正相關(guān)性,堿處理有助于多糖的溶出,加入少量硼氫化鉀可防止堿對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的降解；多糖得率：復(fù)合酶法>堿提法>水提法,且復(fù)合酶提取得率高于單一酶法提取[23]；雖然酶法提取較為溫和,但提取過程由于需要考慮調(diào)整pH,可能會(huì)出現(xiàn)多糖提取液黏度增大、難過濾、蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多等問題[24],但銀耳多糖提取液在pH 4.5～10.5具有良好的酸堿穩(wěn)定性。

表3 不同提取方法對(duì)銀耳多糖得率以及結(jié)構(gòu)的影響

Table3 Effects of different extraction methods on the yield and structure of Tremella fuciformis polysaccharides

濕法打漿是部分真菌多糖提取方法的前處理步驟,但目前只在銀耳提取中應(yīng)用較多,暫無發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于其他真菌多糖的提取。當(dāng)銀耳吸水膨脹后,組織結(jié)構(gòu)和質(zhì)地變得松軟,打漿機(jī)更易將組織細(xì)胞打碎從而溶出更多的多糖,濕法打漿能較好地保護(hù)銀耳多糖結(jié)構(gòu)。但由于銀耳吸水后的細(xì)胞組織膨大,加上其膠質(zhì)和糖類的溶解作用,導(dǎo)致打漿后的銀耳提取液變黏稠而過濾困難。為提高過濾的效率,可采用提高料液比或離心后再用200目濾網(wǎng)過濾的方式進(jìn)行處理,可減少溶液過濾而堵住濾孔。陳麗娟等[25]發(fā)現(xiàn)濕法打漿的得率是傳統(tǒng)熱水浸提法的2.2 倍,時(shí)間僅為其1/60,主要影響因素大小為：料液比>打漿時(shí)間>加水的溫度,濾渣中多糖含量?jī)H為(1.13±0.21)%,效能顯著提升,2種方法提取的銀耳多糖分子質(zhì)量十分相近。

2.4 杏鮑菇多糖

杏鮑菇多糖為一種吡喃型多聚糖,ZHENG等[29]從中分離了2種多糖,其中一種由(1→4)-D-葡萄糖、(1→3,4)-D-葡萄糖、(1→6)-D-半乳糖、(1→3)-D-甘露糖和端基葡萄糖組成,另一種由(1→4)-D-葡萄糖、(1→3,4)-D葡萄糖、(1→6)-D-半乳糖、(1→3,6)-D-甘露糖、(1→3)-D-甘露糖、(1→3)-D-葡萄糖和端基葡萄糖組成。杏鮑菇子實(shí)體和菌絲中多糖組成成分相同,但是摩爾比例卻有顯著差異,菌絲中葡萄糖摩爾比較高[29]。

熱水提取的杏鮑菇多糖沒有蛋白質(zhì)和核酸,微波和熱水法提取杏鮑菇多糖得率相差不大,但微波提取時(shí)微波可穿透杏鮑菇細(xì)胞直接作用于內(nèi)部,加快杏鮑菇多糖從原料內(nèi)部向外部的界面擴(kuò)散和擴(kuò)散速度,增大多糖溶解度和介質(zhì)驅(qū)動(dòng)力,提取速度提高數(shù)倍[30]。

石翛然[31]利用超聲法提取杏鮑菇多糖,發(fā)現(xiàn)超聲功率在200 W和溫度>60 ℃后得率變化不顯著,可能是由于多糖分子運(yùn)動(dòng)速率減小和分解作用造成。

在溫和的提取條件下為了避免多糖被分解,可以使用酶來輔助提取多糖,凡軍民等[32]通過各單因素顯著性分析對(duì)纖維素酶提取杏鮑菇多糖的最佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)表明隨著加水量的增大,多糖提取率也迅速增加,料液比在1∶30(g∶mL,下同)時(shí)基本達(dá)到最大。取1∶30為最優(yōu)料液比加酶,當(dāng)酶添加量為0.35%時(shí)多糖提取率達(dá)到最高,之后加酶量增加提取率保持不變,這可能是因?yàn)楫?dāng)酶添加量低于最佳酶量時(shí),杏鮑菇酶解不完全導(dǎo)致多糖溶出較少,當(dāng)酶添加量超過最佳時(shí),酶與底物接觸面積過剩反而降低了反應(yīng)速率。由此可得出料液比1∶30、酶添加量0.35%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h、酶提一次為最優(yōu)提取條件,在該條件下多糖提取率可達(dá)到18.57%,各提取方法如表4所示。

表4 不同提取方法對(duì)杏鮑菇多糖得率以及結(jié)構(gòu)的影響

Table4 Effect of different extraction methods on yield and structure of Pleurotus eryngii polysaccharides

多糖的分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)是影響多糖功能性的主要因素,蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的,含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等共20多種的復(fù)合酶,JIAO等[33]發(fā)現(xiàn)使用蝸牛酶法提取的杏鮑菇多糖為非均一性多糖,平均分子質(zhì)量為29.3 kDa；與熱水提取的多糖分子質(zhì)量相比有較大提升。REN等[34]從杏鮑菇子實(shí)體中得到的2種組分的多糖,分子質(zhì)量分別為25.4 kDa和463 kDa,且較高分子質(zhì)量多糖抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)效果較好,多糖結(jié)構(gòu)差異較大的原因可能是由于不同栽培品種、培養(yǎng)條件和提取程序的差異所致。

2.5 金針菇多糖

金針菇子實(shí)體多糖是由D-半乳糖、D-甘露糖、L-巖藻糖和D-葡萄糖組成的均一雜多糖,多糖主鏈由(1→2,4)-α-D-吡喃半乳糖、(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖和(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖構(gòu)成,其中(1→4)-α-D-吡喃半乳糖上連接著(1→3)-α-D-吡喃甘露糖分支,以及連接在(1→3)-β-D-葡萄糖上的(1→6)-α-L-吡喃果糖分支。金針菇菌絲體中已分離提純出2種多糖,單糖組成和連接方式均不同,一種由葡萄糖、半乳糖、甘露糖組成,并以α-D-(1→4)糖苷鍵連接主鏈,且?guī)в笑?D-(1→6)分支;另一種結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖組成,此外在葡萄糖端基碳具有α、β兩種構(gòu)型。

熱水、超聲、微波和酶法提取后的金針菇多糖含有一定的蛋白質(zhì),但不含淀粉、還原糖、糖醛酸或多酚；多糖得率和蛋白含量基本呈正相關(guān)關(guān)系(微波>超聲波>熱水>酶解)[35]。超聲提取法提取金針菇多糖后,空化氣泡在粉末組織接觸點(diǎn)產(chǎn)生很強(qiáng)的擠壓力,使表面更易滲透破裂,并促進(jìn)擴(kuò)散過程,所產(chǎn)生的多糖得率、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量較高,作用產(chǎn)生的瞬時(shí)高壓或剪切力可破壞金針菇多糖鏈的三螺旋結(jié)構(gòu)并降解為分子質(zhì)量多糖[36]。

微波輔助酶法提取,利用微波深入滲透細(xì)胞,快速升高提取溫度；黃瓊等[4]使用微波輔助纖維素酶、果膠酶及2種復(fù)合酶混合物提取金針菇多糖,發(fā)現(xiàn)果膠酶效果更好,原因可能是果膠酶能破壞金針菇組織間質(zhì)中的胞間連結(jié)構(gòu)促進(jìn)多糖釋放。游麗君等[37]使用纖維素酶、果膠酶、內(nèi)切木聚糖酶、木瓜蛋白酶、胰酶分別作用于金針菇多糖,發(fā)現(xiàn)其中果膠酶和纖維素酶(特別是果膠酶)相比另外3種酶具有較好地特異性保護(hù)多糖主要組分片段,與原多糖具有相似的單糖組成,也說明果膠酶很可能是單一作用于細(xì)胞壁而非多糖的機(jī)制提高多糖得率。不同提取方法的金針菇多糖得率以及結(jié)構(gòu)變化如表5所示。

表5 不同提取方法對(duì)金針菇多糖得率以及結(jié)構(gòu)的影響

Table5 Effects of different extraction methods on the yield and structure of Flammulina velutipes polysaccharides

濕法超微粉碎技術(shù)首先使用膠體磨對(duì)金針菇進(jìn)行膠磨,隨后85 ℃熱水提取90 min,其多糖得率較熱水提取工藝提高75 %,但在此基礎(chǔ)上再輔助超聲波或微波工藝則得率提高并不顯著；磨齒間隙越小越有利于細(xì)胞壁破壁,但植物細(xì)胞粒子太小會(huì)導(dǎo)致顆粒表面積吸附一部分金針菇多糖,磨齒間隙設(shè)置為42 μm時(shí)提取效果較優(yōu)[38]。

2.6 香菇多糖

具有三股螺旋構(gòu)象的香菇多糖重復(fù)單元不同于同樣具有三螺旋構(gòu)象真菌-裂褶菌(Schizophyllum commune Fr)所產(chǎn)的胞外多糖。ZHANG等[40]發(fā)現(xiàn)香菇多糖是一種以β-(1→3)-D-葡聚糖為多糖,且每5個(gè)線性(1→3)-β-吡喃葡萄糖苷鍵中具有2個(gè)(1→6)-β-吡喃葡萄糖糖的分支；而裂褶菌多糖也是以β-(1→3)-D-葡聚糖為主鏈,但每3個(gè)β-(1→3)-D-吡喃葡萄糖苷具有一個(gè)β-(1→6)-D-吡喃葡萄糖苷的分支。香菇子實(shí)體和菌絲體所提取多糖的單糖組成成分差別不大,主要有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖。不同的品種存在細(xì)微差別,部分香菇子實(shí)體分離得到的多糖中沒有發(fā)現(xiàn)鼠李糖成分。

酸堿溶液相比熱水提取可顯著提高香菇多糖的得率,其中HCl濃度在0～0.4 mol/L,NaOH在0～0.8 mol/L時(shí)濃度與提取率呈正相關(guān),這可能由于酸堿可溶解大量單糖和其他物質(zhì)所致[41]。與超聲復(fù)合酶法相比,單純超聲提取的多糖得率較低,這可能由于在酶作用下其首先破壞細(xì)胞壁和組織,導(dǎo)致固液相的接觸表面積更大,進(jìn)而使溶劑更好地接觸細(xì)胞內(nèi)活性成分。ZHAO等[42]在采用單一超聲提取香菇多糖的過程中發(fā)現(xiàn),超聲功率對(duì)香菇多糖得率的影響最大,其次為提取時(shí)間和溫度。超聲復(fù)合酶法提取香菇多糖時(shí)先使用超聲處理將細(xì)胞震碎,隨后酶作用位點(diǎn)隨之暴露,有利于加速酶和底物的反應(yīng)；同時(shí)利用超聲的空穴化作用將細(xì)胞進(jìn)一步震碎也能提高多糖得率,但超聲功率過大,其產(chǎn)生的熱效應(yīng)可能會(huì)影響酶的活性和得率；提取溫度對(duì)得率影響不顯著,在室溫(25 ℃)下就可以進(jìn)行提取,得到的香菇多糖可保持良好的DPPH清除活性[43]。

LI等[44]利用高壓蒸煮法提取香菇多糖,與熱水法相比,高壓處理可以通過破壞氫鍵和疏水力來提高得率,但不會(huì)降解包括共價(jià)鍵在內(nèi)的主鏈,增強(qiáng)溶劑向原料的傳質(zhì),并改善可溶性成分,此處理得到的多糖分子質(zhì)量也較低,這可能由于分子團(tuán)聚體在高壓環(huán)境下溶解所致,但對(duì)多糖組成成分并無明顯差異。

動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)是一種新興的動(dòng)態(tài)高壓剪切技術(shù),與高靜水技術(shù)壓不同,其可產(chǎn)生高速?zèng)_擊、高頻振動(dòng)、瞬時(shí)壓降、強(qiáng)剪切、空化和高達(dá)200 MPa的超高壓的合力；在提取香菇多糖時(shí)主要通過3個(gè)因素影響得率：(1)可能通過結(jié)合剪切、沖擊力和高頻振動(dòng)來提高傳質(zhì)速率和細(xì)胞破碎程度；(2)細(xì)胞內(nèi)外的壓力差增大導(dǎo)致溶劑通量增大并加快效率；(3)空化引起的植物細(xì)胞解體。如表6所示,與熱水提取法相比,此法提取后的多糖得率提高,但分子質(zhì)量由965.361 kDa降低為913.329 kDa,這可能是由于高壓機(jī)械力和空化作用導(dǎo)致的多糖降解,多糖表面變得更加松散[45]。

表6 不同提取方法對(duì)香菇多糖得率以及結(jié)構(gòu)的影響

Table 6 Effects of different extraction methods on yield and structure of Lentinus edodes polysaccharides

2.7 猴頭菇多糖

不同提取方法對(duì)猴頭菇多糖得率以及結(jié)構(gòu)的影響如表7所示。WANG等[47]報(bào)道了猴頭菇子實(shí)體中得到的多糖大多數(shù)是由2種或多種單糖組成的雜多糖,當(dāng)前的研究表明,雜多糖中廣泛存在(1→6)連接的α-D-吡喃半乳糖基骨架,并且分支通常由O-2位置的α-L-呋喃葡糖組成。并且還發(fā)現(xiàn)具有(1→6)-連接的β-D-吡喃葡萄糖基殘基作為主鏈并且具有(1→3)-連接的β-D-吡喃葡萄糖基支鏈的結(jié)構(gòu),其主要由巖藻糖、葡萄糖和半乳糖組成,某些品種含有少量的甘露糖。菌絲體的單糖組成成分和子實(shí)體有明顯差異,主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成,其中半乳糖的含量比子實(shí)體高。猴頭菇的高分子質(zhì)量多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性和生物活性,此外甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖的單糖組成也與其生物活性有關(guān)。

單一酶法指提取時(shí)僅用一種酶輔助提取食用菌多糖,而復(fù)合酶法為多種酶聯(lián)合使用提取。張素斌等[48]分別采用2種酶法分別提取猴頭菇多糖,單一木瓜蛋白酶加酶量為0.5%,溫度50 ℃,提取時(shí)間90 min,pH 4,多糖提取率為9.77%；復(fù)合酶的加酶量為纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶各0.5%,其他相同條件下提取率提高至10.89%。ZHU等[49]使用復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖時(shí)發(fā)現(xiàn),與熱水法相比得率可提高67.72%,產(chǎn)生的多糖為陽性(熱水提取為陰性),但不改變基團(tuán)結(jié)構(gòu)；可能由于適宜的pH值對(duì)酶空間結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和活性有影響,由分支和相互纏結(jié)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楦L(zhǎng)的多糖鏈并增加了分子柔韌性,這種變化是由葡萄糖的船-椅式構(gòu)象轉(zhuǎn)變所引起,此外酶的種類如細(xì)胞壁降解酶會(huì)削弱或破壞細(xì)胞壁(即纖維素),使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)更易于提??；相比熱水浸提法復(fù)合酶提取后產(chǎn)物中有較高比例的葡萄糖,而甘露糖和木糖的比例減少；對(duì)酶輔助提取得率的影響因素相對(duì)大小為：pH>溫度>時(shí)間>酶濃度。超聲復(fù)合酶法為在復(fù)合酶法的基礎(chǔ)上輔助增加超聲條件,超聲的聲空化作用有利于單一復(fù)合酶法的提取,提取率由10.89%提高至15.59%[48]。

多糖可溶于水、酸、堿,而不溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑,通過不同溶劑提取對(duì)多糖結(jié)構(gòu)也具有影響。YAN等[50]對(duì)不同溶劑提取猴頭菇多糖的效果進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在相同的提取時(shí)間和溫度下堿提法優(yōu)于酸提法,特別是在95 ℃時(shí)可溶性長(zhǎng)鏈多糖降解為短鏈的酸水解作用較強(qiáng),短鏈游離糖可能不會(huì)被乙醇所沉淀；堿提過程中的堿可破壞細(xì)胞壁中纖維素與半纖維素之間的氫鍵,使不溶性多糖轉(zhuǎn)化為可溶性,以上2種情況都導(dǎo)致酸提法的得率較低,并且不同的萃取溶劑對(duì)多糖組成成分的影響不大,差別可能是由于原料來源和提取方法。不同溶劑提取的猴頭菇多糖都有2個(gè)主要的組分,如表7所示,熱水提取法的2種多糖組分分子質(zhì)量分別為597.6和314.7 kDa,鹽提法為449.4和442.7 kDa,酸提法為263.6和229.8 kDa,堿提法為320.8和256.8 kDa；酸堿提取的多糖具有更高的蛋白質(zhì)含量,此外分子質(zhì)量和黏度明顯低于熱水和鹽提取法,表明在此過程中多糖鏈可能受到一定程度的破壞和降解,一部分高分子質(zhì)量組分轉(zhuǎn)化為低分子質(zhì)量組分,從而增加了猴頭菇多糖中低分子質(zhì)量組分的含量；不同溶劑提取對(duì)猴頭菇多糖的有機(jī)基團(tuán)并無顯著影響[50]。

表7 不同提取方法對(duì)猴頭菇多糖得率以及結(jié)構(gòu)的影響

Table7 Effects of different extraction methods on the yield and structure of Hericium erinaceus polysaccharide

3 結(jié)論

真菌多糖作為真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性成分存在,由2種主要類型的多糖組成：一種是由幾丁質(zhì)(或纖維素)組成的剛性原纖維結(jié)構(gòu),另一種是由α-葡聚糖、β-葡聚糖和糖蛋白組成的基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。不同提取方法提取的真菌多糖,由于提取工藝的差異對(duì)多糖得率、分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)等因素具有不同影響。與熱水和酶法相比,超聲和微波提取具有更高的效率、產(chǎn)量和更短的提取時(shí)間。超聲波提取法主要利用聲空化產(chǎn)生的氣穴氣泡的高強(qiáng)度沖擊作用力產(chǎn)生強(qiáng)烈的壓力、剪切力和溫度梯度作用于細(xì)胞,使真菌細(xì)胞壁和糖鏈斷裂,對(duì)大多數(shù)真菌多糖而言,超聲處理可較好地提高效率,但在得率上具有差異,如銀耳多糖較高,但對(duì)靈芝多糖作用不大,可能由于靈芝多糖受溫度影響較大。微波輔助提取技術(shù)可穿透萃取介質(zhì),直接作用于物質(zhì)內(nèi)部,使材料內(nèi)部累積了相當(dāng)大的壓力,這種高壓極大地破壞真菌細(xì)胞并改善組織的毛細(xì)孔結(jié)構(gòu),增大了多糖溶解度并加速目標(biāo)物質(zhì)的擴(kuò)散,微波功率對(duì)得率的影響比提取溫度和時(shí)間等因素更大,此方法對(duì)金針菇多糖提取較為有效。酶法提取主要為酶對(duì)真菌細(xì)胞壁組織的酶解和多糖溶出作用,加速目標(biāo)化合物從組織向周圍環(huán)境的遷移并增加接觸面積,是最溫和且多糖保留較好的一種方式,有趣的是蛋白酶對(duì)真菌多糖也具有一定的效果,如木瓜和酸性蛋白酶分別對(duì)靈芝和蟲草多糖的提取效果較好,對(duì)杏鮑菇而言則是纖維素酶較好等；當(dāng)酶復(fù)配使用時(shí)要注意各種酶的加酶量,過多也可能會(huì)導(dǎo)致多糖分解,此外特別需要注意溫度、時(shí)間和最適pH值,才能發(fā)揮最大提取效能。酸堿可降解多糖中的鏈和鍵,增加多糖溶解率等,但采用酸法提取時(shí)溫度不宜過高,酸性多糖或糖醛酸含量高的多糖可采用堿提取法,適量濃度的堿能破除細(xì)胞壁聚合物分子間的結(jié)構(gòu),但過高濃度會(huì)造成多糖水解。酸堿法提取香菇多糖的得率最高,提取效果取決于酸堿濃度,香菇多糖堿濃度為0.8 mol/L、酸為0.4 mol/L,猴頭菇最適堿濃度為1.25 mol/L；采用這些提取方法效率比傳統(tǒng)熱水提取的得率更高,所得多糖的生物活性和自由基清除能力等也會(huì)相對(duì)提高,但是相對(duì)分子質(zhì)量有所降低。

食用菌多糖在臨床治療疾病具有重要作用,這需要多糖具有較高的活性,因此如何獲得具有更高活性的多糖還需要進(jìn)一步的研究。目前用于藥用的真菌多糖大部分為單一多糖,各多糖間的協(xié)同作用也是今后研究的方向之一。