生物法合成4-羥基異亮氨酸的代謝工程研究進(jìn)展

4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine)為L-異亮氨酸的羥化物,是一種非蛋白質(zhì)氨基酸,最早發(fā)現(xiàn)于胡蘆巴種子中[1]。研究表明4-羥基異亮氨酸具有血糖濃度依賴的促進(jìn)胰島素分泌的活性,且可增強(qiáng)受體對胰島素的敏感性；同時,4-羥基異亮氨酸還具有促進(jìn)肌細(xì)胞對血糖吸收、加速脂肪代謝、降血脂和保護(hù)肝功能的作用[2-4]。作為有效預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病及肥胖癥的理想潛在藥物,4-羥基異亮氨酸具有廣泛的應(yīng)用前景和市場需求[5]。本文總結(jié)了4-羥基異亮氨酸的功能和合成方法,重點(diǎn)綜述了生物法合成4-羥基異亮氨酸的代謝工程策略。

1 4-羥基異亮氨酸的生物學(xué)功能

研究人員已發(fā)現(xiàn)8種構(gòu)型的4-羥基異亮氨酸,但僅(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸具有生物學(xué)活性[1]。SAUVAIRE等[6]研究表明,4-羥基異亮氨酸在小鼠體外和體內(nèi)均可促進(jìn)胰島素分泌,且4-羥基異亮氨酸的促胰島素分泌作用具有血糖濃度依賴的特性：在低(3 mmol/L)或正常(5 mmol/L)血糖濃度下,4-羥基異亮氨酸沒有明顯的促胰島素分泌作用；而在高血糖濃度下(6.6～16.7 mmol/L),4-羥基異亮氨酸顯著促進(jìn)胰島素分泌,且與血糖濃度呈正相關(guān)趨勢。MASIELLO等[7]研究發(fā)現(xiàn),注射了4-羥基異亮氨酸的II型糖尿病病鼠干細(xì)胞和肌細(xì)胞吸收利用血糖的速率明顯增加。MAURYA等[8]發(fā)現(xiàn)4-羥基異亮氨酸能夠有效提高胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平。SHARMA等[9]報道胡蘆巴種子能夠改善血脂異常,飼喂4-羥基異亮氨酸的小鼠甘油三酯、總膽固醇、甘油和游離脂肪酸的濃度明顯下降。近年來研究發(fā)現(xiàn),4-羥基異亮氨酸能夠調(diào)控脂類代謝相關(guān)基因,還可緩解代謝綜合癥及巨噬細(xì)胞相關(guān)的慢性炎癥[3-4]。目前尚未發(fā)現(xiàn)4-羥基異亮氨酸對機(jī)體產(chǎn)生副作用[6]?；谏鲜鎏匦?4-羥基異亮氨酸被視為治療糖尿病、高血脂和肥胖的潛在藥物。

2 4-羥基異亮氨酸的生產(chǎn)

4-羥基異亮氨酸目前主要的生產(chǎn)方法有種子提取法、化學(xué)合成法、化學(xué)-酶法、酶法、微生物轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。

2.1 種子提取法

胡蘆巴種子中4-羥基異亮氨酸占總氨基酸的80%,且有效構(gòu)型(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸約占90%[1,10]。目前僅有提取分離法用于工業(yè)化生產(chǎn)4-羥基異亮氨酸。FOWDEN等[1]首次從胡蘆巴種子中分離得到4-羥基異亮氨酸,其分離方法如下：用20%乙醇浸提胡蘆巴種子,浸提液經(jīng)Zeokarb 225柱(100 cm×10 cm,H+-型)分離并用氨水洗脫后獲得氨基酸組分；洗脫液經(jīng)真空濃縮后再用Dowex 50×8柱(100 cm×5 cm,H+-型)分離、氨水洗脫,洗脫液經(jīng)濃縮結(jié)晶后獲得4-羥基異亮氨酸粗品,其收率僅為0.091%。SAUVAIRE等[11]采用70%乙醇浸提-Amberlite IR 120 H+-型柱分離-氨水洗脫-薄層析分離-氯仿/甲醇/水洗脫-結(jié)晶的方法將總收率提升至0.6%。李玉山[12]進(jìn)一步簡化提取工藝,得到了純度為40%的4-羥基異亮氨酸粗品,收率為0.32%。盡管提取法是目前工業(yè)化生產(chǎn)4-羥基異亮氨酸的主要手段,但存在原材料需求量大、分離純化困難、提取率低(0.091%～0.6%)、成本高等不足。

2.2 化學(xué)合成法

化學(xué)法以葡萄糖、薄荷酮或α-甲基乙酰乙酸乙酯等為原料經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)生成4-羥基異亮氨酸。BEN-ISHAI等[13]首次報道了利用化學(xué)法合成4-羥基異亮氨酸,該方法以α-甲基乙酰乙酸乙酯和α-羥基苯甲酰氨基乙酸為底物先制備4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯,然后再合成4-羥基異亮氨酸。GULL等[14]在合成高絲氨酸的過程中,通過手性甘氨酸陰離子的等價物(雜環(huán)中間體)和環(huán)氧丁烷的不對稱反應(yīng)得到(3R,4R,5R)-和(3R,4S,5S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯異構(gòu)體的混合物(97.5∶2.5),總收率24%。INGHARDT等[15]利用三甲基鋁連續(xù)誘發(fā)的芐基-2,3-脫水-4-O-叔丁基二甲基硅-γ-L-吡喃核糖苷的環(huán)氧和吡喃糖苷開環(huán)反應(yīng),合成了4-羥基異亮氨酸的兩種對映異構(gòu)體,(2S,3R,4R)-4-羥基異亮氨酸和(2S,3R,4R)-4-羥基異亮氨酸及相應(yīng)的內(nèi)酯。陳平等[16]對條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化,包括對甲氧基苯胺和乙醛酸乙酯依次經(jīng)縮合、(S)-脯氨酸催化不對稱Mannich反應(yīng)和1,8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一烷-7-烯不對稱轉(zhuǎn)化制得(2S,3R)-2-(4-甲氧基苯胺基)-3-甲基-4-氧代戊酸乙酯,再經(jīng)硝酸鈰銨氧化脫保護(hù)、硼氫化鈉還原和氫氧化鋰水解得(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸,總收率約達(dá)到30%?？傮w而言,化學(xué)法分離困難、收率低(21%～30%),因此仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段。

2.3 化學(xué)-酶法及酶法

化學(xué)-酶法首先采用化學(xué)法合成4-羥基異亮氨酸前體物,然后再通過酶法合成4-羥基異亮氨酸。WANG等[17]首次報道了通過化學(xué)-酶合成法合成4-羥基異亮氨酸：先采用化學(xué)法合成2-甲基乙酰乙酸乙酯,然后利用白地霉(Geotrichum candidum)生物轉(zhuǎn)化生成4-羥基異亮氨酸,總反應(yīng)共8步,總收率為39%。FULCRAND等[18]先采用化學(xué)法合成N-苯基乙酰內(nèi)酯,再利用環(huán)氧樹脂固化的青霉素?；复呋?-羥基異亮氨酸,總反應(yīng)共6步,總收率為38%。SMIRNOV等[19]報道了2步法合成4-羥基異亮氨酸,使用乙醛和α-酮丁酸在醛縮酶的作用下進(jìn)行醛縮反應(yīng),其產(chǎn)物在分支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下合成4-羥基異亮氨酸,盡管該方法大大簡化了提取步驟,但是底物α-酮丁酸的轉(zhuǎn)化率僅為4.3%。

SHI等[20]通過特異性位點(diǎn)突變的方法改造了短鏈脫氫酶/還原酶家族的4-羥基異亮氨酸脫氫酶,使其能夠特異性催化(2S,3R)-2-氨基-3-甲基-4-酮戊二酸生成4-羥基異亮氨酸,其中(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸的純度可達(dá)99.1%。酶法可特異性生成(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸,解決了化學(xué)法和化學(xué)-酶法產(chǎn)生4-羥基異亮氨酸構(gòu)型較多的問題。然而,該方法所用底物(2S,3R)-2-氨基-3-甲基-4-酮戊二酸不易獲取致使生產(chǎn)成本高。

2.4 生物法

生物法合成4-羥基異亮氨酸是在發(fā)現(xiàn)L-異亮氨酸雙加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)的基礎(chǔ)發(fā)展起來的,根據(jù)是否添加底物L(fēng)-異亮氨酸和(或)α-酮戊二酸可分為微生物轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。HAEFELé等[21]在胡蘆巴種子破碎液中發(fā)現(xiàn)能夠?qū)-異亮氨酸轉(zhuǎn)化為(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸的活性組分,但至今未見后續(xù)研究報道。KODERA等[22]首次于蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis 2e2 AKU 0251中發(fā)現(xiàn)了IDO,該酶能夠特異性催化L-異亮氨酸合成(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸(圖1)；并證實(shí)其屬于α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶家族。

圖1 IDO 催化生成 4-羥基異亮氨酸的反應(yīng)

Fig.1 The reaction for synthesis of 4-hydroxyisoleucine catalyzed by IDO

KIVERO等[23]將上述IDO編碼基因ido轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,通過在發(fā)酵過程中添加前體物L(fēng)-異亮氨酸實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化法合成4-羥基異亮氨酸,在優(yōu)化條件下產(chǎn)量達(dá)到24.0 g/L,但該方法存在L-異亮氨酸被額外消耗及耗糖高等不足。SHI等[24-26]利用谷氨酸棒桿菌過表達(dá)ido,在添加α-酮戊二酸并優(yōu)化條件下經(jīng)144 h發(fā)酵,最高產(chǎn)量達(dá)到14.1 g/L。張成林等[27]從蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis TCCC 11826中克隆出ido(Accession No.KC884243),其編碼的IDO氨基酸序列與KODERA報道的IDO相似性為97.91%,Km和Vmax分別為0.18 mmol/L和2.10 μmol/(min·mg),催化效率略高于后者；在此基礎(chǔ)上,利用該基因分別于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌建立了微生物轉(zhuǎn)化法4-羥基異亮氨酸合成體系,4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到6.6 g/L和5.3 g/L。ZHANG等[28]根據(jù)IDO偶聯(lián)異亮氨酸羥化反應(yīng)和α-酮戊二酸氧化反應(yīng)的特性,利用琥珀酸缺陷型菌株建立了高活性IDO的高通量篩選體系,獲得了催化效率顯著提高的IDO突變體IDOL27I/E80D/G169H/S18D；利用該突變體可催化生成22.4 g/L 4-羥基異亮氨酸,轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.7%。為進(jìn)一步提高4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化效率,李英滋等[29]構(gòu)建了ido表達(dá)菌株Escherichia coli pET-ido并利用該細(xì)胞建立和優(yōu)化了合成4-羥基異亮氨酸的靜息細(xì)胞催化體系,4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到36.7 g/L和99.8%。DU等[30]通過易錯PCR結(jié)合基于NADH檢測的高通量篩選方法篩選獲得突變體IDOI162T/T182 N,表達(dá)該酶的靜息細(xì)胞可將29.9 g/L L-異亮氨酸完全轉(zhuǎn)化成4-羥基異亮氨酸。

總體而言,上述方法存在周期長,需添加1～2種前體物等不足,限制了4-羥基異亮氨酸的規(guī)?；a(chǎn)。與之相比,直接發(fā)酵法是以葡萄糖為碳源,無需添加前體物L(fēng)-異亮氨酸和α-酮戊二酸便可生成4-羥基異亮氨酸,故備受關(guān)注。TAN等[31]利用動態(tài)調(diào)控三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán),增加菌株攝氧等策略實(shí)現(xiàn)4-羥基異亮氨酸的直接發(fā)酵合成,經(jīng)144 h培養(yǎng)可生成19.9 g/L 4-羥基異亮氨酸[31]。ZHANG等[32]于L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株Corynebacterium glutamicum YI中構(gòu)建4-羥基異亮氨酸合成途徑,并通過靜態(tài)調(diào)控結(jié)合動態(tài)調(diào)控等系統(tǒng)代謝工程手段,獲得1株4-羥基異亮氨酸高產(chǎn)菌株HIL18,該菌株以葡萄糖前體物可生成34.2 g/L的4-羥基異亮氨酸,為已報道直接發(fā)酵法合成4-羥基異亮氨酸的最高產(chǎn)量。

3 4-羥基異亮氨酸的生物合成途徑

目前已在蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等芽孢桿菌屬中發(fā)現(xiàn)IDO,表明該類細(xì)菌含有4-羥基異亮氨酸的生物合成途徑[30,33]。如圖2所示,4-羥基異亮氨酸的生物合成途徑以L-異亮氨酸和α-酮戊二酸為前體,由IDO催化生成。

圖2 4-羥基異亮氨酸的生物合成途徑及其代謝工程改造策略

Fig.2 Biosynthesis pathway of 4-hydroxyisoleucine and strategies for its metabolic engineering

Glc-葡萄糖；6-PG-6-磷酸葡萄糖酸；PEP-磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr-丙酮酸；Ac-CoA-乙酰輔酶A；Cit-檸檬酸；Isocit-異檸檬酸；α-KG-α-酮戊二酸；Suc-CoA-琥珀酰輔酶A；Succ-琥珀酸；Fum-延胡索酸；Mal-蘋果酸；OAA-草酰乙酸；OAA-草酰乙酸；Asp-天冬氨酸；Asp-P-天冬氨酸磷酸；ASA-天冬氨酸-β-半醛；Homo-高絲氨酸；Hom-P-高絲氨酸磷酸；Thr-蘇氨酸；α-KB-α-酮基丁酸；AHB-α-乙?；?α-羥基丁酸；DMV-α-β-二羥基-β-甲基戊酸；KMV-α-酮基-β-甲基戊酸；AL-α-乙酰乳酸；DIV-α-β-二羥基異戊酸；KIV-α-酮基異戊酸；Ile-異亮氨酸；Val-纈氨酸；Leu-亮氨酸；4-HIL-4-羥基異亮氨酸；ppc-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因；pyc-丙酮酸羧化酶編碼基因；zwf-6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；edd-6-磷酸葡萄糖酸脫水酶；edd-2-酮基-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸醛縮酶；gltA-檸檬酸合酶編碼基因；icd-異檸檬酸脫氫酶編碼基因；aceA-異檸檬酸裂解酶編碼基因；sucAB-α-酮戊二酸脫氫酶編碼基因；sucCD-琥珀酰輔酶A合酶編碼基因；lysC-天冬氨酸激酶編碼基因；thrA-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶編碼基因；asd-天冬氨酸半醛脫氫酶編碼基因；thrB-高絲氨酸激酶編碼基因；thrC-蘇氨酸合成酶編碼基因；ilvA-蘇氨酸脫氫酶編碼基因；ilvBN-乙酰羥基酸合成酶編碼基因；ilvC-二羥酸還原異構(gòu)酶編碼基因；ilvD-二羥酸脫水酶編碼基因；ilvE-分支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶

葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸,二者分別在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶的作用下發(fā)生羧化反應(yīng),生成草酰乙酸。草酰乙酸和乙酰輔酶A依次在檸檬酸合酶、順烏頭酸酶及異檸檬酸脫氫酶的作用下生成α-酮戊二酸,其中檸檬酸合酶或(和)異檸檬酸脫氫酶為限速酶。α-酮戊二酸可經(jīng)α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體催化生成琥珀酰輔酶A繼續(xù)完成TCA循環(huán),也可在谷氨酸脫氫酶的催化下生成谷氨酸,還可與谷氨酰胺經(jīng)谷氨酸合酶催化生成谷氨酸[34]。

草酰乙酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成L-天冬氨酸,并由天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、蘇氨酸脫氫酶、乙酰羥基酸合成酶、二羥酸還原異構(gòu)酶、二羥酸脫水酶和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化經(jīng)10步反應(yīng)生成L-異亮氨酸[35-36]。生成的α-酮戊二酸和L-異亮氨酸經(jīng)IDO催化,在Fe2+存在的條件下生成4-羥基異亮氨酸,同時生成CO2。

4 4-羥基異亮氨酸生產(chǎn)菌株代謝工程選育

目前生物合成4-羥基異亮氨酸的代謝工程研究集中于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。主要代謝工程策略包括構(gòu)建合成途徑、強(qiáng)化L-異亮氨酸合成、重構(gòu)中代謝途徑及增強(qiáng)輔因子合成等(表1)。

表1 4-羥基異亮氨酸生產(chǎn)菌株改造策略

Table 1 Strategies for metabolic engineering construction of 4-hydroxyisoleucine producing strain

注：-未報道

4.1 構(gòu)建4-羥基異亮氨酸合成途徑

大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌均不含ido,因此首先于菌株中表達(dá)外源ido構(gòu)建4-羥基異亮氨酸合成途徑。OGAWA等[33]于大腸桿菌E.coli Rosetta2(DE3)過表達(dá)了來源于B.thuringiensis ATCC 35646的ido,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,在添加α-酮戊二酸和L-異亮氨酸的條件下可合成1.9 g/L 4-羥基異亮氨酸。SHI等[34]利用來源于B.thuringiensis YBT-1520的ido于L-異亮氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01構(gòu)建了4-羥基異亮氨酸合成途徑；獲得的菌株Cgl/p4-ido經(jīng)120 h搖瓶發(fā)酵產(chǎn)4-羥基異亮氨酸5.3 g/L,經(jīng)優(yōu)化生物素的添加量4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到9.6 g/L。ZHANG等[32]于L-異亮氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicum YI中過表達(dá)經(jīng)密碼子優(yōu)化的ido(來源于B.thuringiensis TCCC 11826),經(jīng)搖瓶發(fā)酵48 h,獲得的菌株HIL04可產(chǎn)3.3 g/L 4-羥基異亮氨酸。SHI等[39]考察了18種核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列對4-羥基異亮氨酸合成的影響,其產(chǎn)量范圍為 1.2～15.3 g/L,由此可見ido的轉(zhuǎn)錄水平對4-羥基異亮氨酸合成影響較為顯著。

4.2 強(qiáng)化L-異亮氨酸合成

草酰乙酸是合成L-異亮氨酸的重要前體物質(zhì)。在谷氨酸棒桿菌中,草酰乙酸主要來源于由丙酮酸羧化酶(由pyc編碼)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(由ppc編碼)催化丙酮酸羧和磷酸烯醇式丙酮酸的回補(bǔ)途徑[35]。SHI等[25]于4-羥基異亮氨酸菌株Cgl/p4-ido過表達(dá)ppc使得4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量由10.9 g/L提升至14.1 g/L。ZHANG等[32]比較了過表達(dá)pyc和ppc對4-羥基異亮氨酸合成的影響,發(fā)現(xiàn)二者均能顯著提升其合成效率,4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量及生物量分別提高19%和31%及28.8%和42.3%,可見過表達(dá)ppc的效果優(yōu)于pyc[32]。L-蘇氨酸是合成L-異亮氨酸的直接前體物質(zhì),天冬氨酸激酶是該途徑中的關(guān)鍵酶。然而在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)天冬氨酸激酶編碼基因lysC抑制了4-羥基異亮氨酸的合成[25]；推測過表達(dá)lysC使L-異亮氨酸合成代謝流過強(qiáng),與α-酮戊二酸合成競爭前體物草酰乙酸。草酰乙酸可由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化,生成磷酸烯醇式丙酮酸,但敲除其編碼基因pck對4-羥基異亮氨酸的合成無明顯影響[32]。丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸,故與草酰乙酸的合成競爭磷酸烯醇式丙酮酸。盡管敲除其編碼基因pyk對4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量無顯著影響,但可明顯降低L-亮氨酸和L-丙氨酸等副產(chǎn)物積累[32]。

4.3 重構(gòu)中心代謝途徑

4.3.1 中心代謝途的靜態(tài)調(diào)控

研究證明,阻斷大腸桿菌ED途徑可提高L-天冬氨酸合成,故可促進(jìn)L-異亮氨酸的合成[40-41]。KIVERO等[23]敲除大腸桿菌E.coli MG1655的ED途徑關(guān)鍵基因edd和eda,卻發(fā)現(xiàn)4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量略有下降。但在此基礎(chǔ)上敲除6-磷酸葡萄糖脫氫編碼基因zwf使得4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量由23.0 g/L提升至24.0 g/L,耗糖降低20%[23]。

檸檬酸合酶(由gltA編碼)和異檸檬酸脫氫酶(由icd編碼)是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶。在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)gltA使4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和生物量分別提高34.7%和9.6%,L-賴氨酸等副產(chǎn)物降低40%以上；在此基礎(chǔ)上過表達(dá)icd使得4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量、單位菌體產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高44.2%、30.2%和29.9%,副產(chǎn)物積累量進(jìn)一步下降[32]。上述結(jié)果表明,過表達(dá)gltA和icd將代謝流“拉”向TCA循環(huán),從而增加α-酮戊二酸的供應(yīng)[32]。乙醛酸循環(huán)與TCA循環(huán)競爭α-酮戊二酸前體物異檸檬酸,敲除其關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA使得4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量提高6.3%[32]。以往認(rèn)為,谷氨酸棒桿菌在碳源充足的條件下乙醛酸循環(huán)并不發(fā)揮作用,該結(jié)果顯示乙醛酸循環(huán)會分配少量的代謝流。

谷氨酸脫氫酶(由gdh編碼)和α-酮戊二酸脫氫酶(在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中分別由sucAB和odhA編碼)可將α-酮戊二酸分別催化生成L-谷氨酸和琥珀酰-CoA,與IDO競爭α-酮戊二酸。敲除谷氨酸棒桿菌中g(shù)dh1顯著降低4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和菌體生物量,而敲除gdh2可使4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量提高8.3%且對菌體生長無顯著影響[32]。該結(jié)果提示谷氨酸棒桿菌2個谷氨酸脫氫酶中,GDH1發(fā)揮更大的作用。由于IDO合成4-羥基異亮氨酸的同時還生成琥珀酸,故該酶能夠重新連接ΔsucAB菌株中阻斷的TCA循環(huán)。SMIRNOV等敲除大腸桿菌E.coli MG1655 的aceA和sucAB并過表達(dá)ido,從而將菌體生長與4-羥基異亮氨酸耦聯(lián)起來,在添加13.2 g/L L-異亮氨酸的條件下合成12.1 g/L 4-羥基異亮氨酸[22]。然而將該策略應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌時,4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和菌體生物量顯著下降,推測可能發(fā)酵前期IDO活性或L-異亮氨酸合成不足致使生成的琥珀酸難以滿足菌體生長[32]。在谷氨酸棒桿菌中,抑制蛋白OdhI與α-酮戊二酸脫氫酶結(jié)合后通過改變其構(gòu)象抑制其活性。但OdhI被絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknG磷酸化后無抑制作用[42]。敲除pknG使得4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量由6.5 g/L提升至12.4 g/L,但仍有11.2 g/L L-異亮氨酸殘留[26]。

4.3.2 中心代謝途的動態(tài)調(diào)控

由圖2可知,4-羥基異亮氨酸的生物合成均涵蓋中心代謝、分支代謝以及能量和輔酶代謝等多個代謝途徑。這些代謝途徑常因競爭共同前體物導(dǎo)致代謝流分配失衡,致使4-羥基異亮氨酸難以高效積累且前體物L(fēng)-異亮氨酸大量殘留[26,32]。近年來了報道的動態(tài)調(diào)控策略有效地協(xié)調(diào)了菌體生長和4-羥基異亮氨酸的高效合成。

L-異亮氨酸等分支鏈氨基酸能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子Lrp與其輸出蛋白編碼基因brnFE啟動子的結(jié)合,從而激活brnFE的轉(zhuǎn)錄[43]。研究發(fā)現(xiàn),OdhI第14位蘇氨酸突變后(T14A)不再被PknG磷酸化,故OdhIT14A一旦與α-酮戊二酸脫氫酶結(jié)合便不易解離[42]。ZHANG等[32]利用brnFE啟動子PbrnFE調(diào)控OdhIT14A編碼基因odhIA40G的轉(zhuǎn)錄,即僅當(dāng)胞內(nèi)有L-異亮氨酸積累時,odhIA40G的轉(zhuǎn)錄被激活,其編碼的OdhIT14A抑制α-酮戊二酸脫氫酶活性從而有更多的α-酮戊二酸用于合成4-羥基異亮氨酸。搖瓶條件下,獲得的菌株4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量由4.95 g/L提升至5.36 g/L(提高8.3%)。SHI等[38]利用不同強(qiáng)度的PbrnFE突變體動態(tài)調(diào)控ido的表達(dá)使得4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量提高6.7；當(dāng)使用相同策略調(diào)控odhIA40GA43G時,4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量卻下降[38]。

谷氨酸棒桿菌ilvBNC操縱子的啟動子中含弱化子,該弱化子中含L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸密碼子,當(dāng)胞內(nèi)有L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸積累時,ilvBNC的轉(zhuǎn)錄受到弱化調(diào)控[44]。ZHANG等[32]利用該特性,將α-酮戊二酸脫氫酶編碼基因odhA啟動子替換為PilvBNC以動態(tài)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄：發(fā)酵前期菌體生長速率高但L-異亮氨酸合成相對較少,此時胞內(nèi)外無過量L-異亮氨酸積累,α-酮戊二酸除部分用于4-羥基異亮氨酸合成外,大部分用于TCA循環(huán)(生長)；發(fā)酵中、后期菌體生長速率降低,且此時當(dāng)胞內(nèi)外有大量L-異亮氨酸積累,odhA轉(zhuǎn)錄被弱化,更多的α-酮戊二酸用于4-羥基異亮氨酸合成。結(jié)果顯示,所獲菌株HIL18的odhA轉(zhuǎn)錄水平與胞內(nèi)L-異亮氨酸濃度呈負(fù)相關(guān)趨勢,odhA的轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降1.5～20倍、α-酮戊二酸脫氫酶活性下降10%～64%,證明PilvBNC能夠很好地響應(yīng)胞內(nèi)L-異亮氨酸濃度從而動態(tài)調(diào)控α-酮戊二酸脫氫酶活性；在發(fā)酵初期即有少量4-羥基異亮氨酸積累,而對照菌株則無,發(fā)酵中期和后期4-羥基異亮氨酸合成速率顯著提升,進(jìn)一步證明了PilvBNC對α-酮戊二酸脫氫酶活性的動態(tài)調(diào)控作用；同時,HIL18的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率較對照菌株分別提高1.3倍和1.5倍,胞外L-異亮氨酸積累由10.98 g/L降低至0.62 g/L,其余副產(chǎn)物降低至0.5 g/L以下,表明動態(tài)調(diào)節(jié)TCA循環(huán)能夠重新分配代謝流、平衡菌體生長和4-羥基異亮氨酸的高效合成,顯著提高葡萄糖利用率[32]。綜合來看,利用OdhI抑制α-酮戊二酸脫氫酶活性的策略對4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量的提升水平有限；相比而言,弱化odhA轉(zhuǎn)錄的效果更為顯著。推測原因是,OdhI對α-酮戊二酸脫氫酶活性的抑制作用是持續(xù)累加的,而odhA轉(zhuǎn)錄的弱化是隨胞內(nèi)L-異亮氨酸水平動態(tài)波動的,故后者效果更佳。

4.4 其他策略

如圖2所示,合成1 mol L-異亮氨酸需要4 mol NADPH,故NADPH供應(yīng)被認(rèn)為是L-異亮氨酸合成的限制因素。研究發(fā)現(xiàn),共表達(dá)zwf和NADH激酶編碼基因pos5可使4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量提高62.18%[26]。IDO催化的羥化反應(yīng)需要O2,故推測菌體的攝氧能力可能影響4-羥基異亮氨酸合成。SHI等[39]過表達(dá)了來源于透明顫菌的血紅蛋白編碼基因vgb使菌株恢復(fù)生長且4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量提升。

總體而言,目前利用谷氨酸棒桿菌直接發(fā)酵合成4-羥基異亮氨酸的研究較大腸桿菌深入。其主原因是,當(dāng)前L-異亮氨酸生產(chǎn)菌均為谷氨酸棒桿菌,同時谷氨酸棒桿菌的α-酮戊二酸合成能力強(qiáng),故在L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增強(qiáng)α-酮戊二酸合成代謝流更易實(shí)現(xiàn)。然而從長遠(yuǎn)來看,現(xiàn)有的L-異亮氨酸生產(chǎn)菌均經(jīng)多輪誘變獲得,存在L-纈氨酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)缺陷,故對營養(yǎng)要求高、生長相對于野生型菌株緩慢。同時,誘變菌株的遺傳性狀較野生型菌株發(fā)生很大改變,且遺傳背景不夠清晰,增加了進(jìn)一步代謝工程選育的難度,大幅度提升合成效率的空間有限。相比而言,大腸桿菌生長快,營養(yǎng)要求低,遺傳背景更為清晰,分子生物學(xué)工具手段更為豐富,故已成為L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸等多種氨基酸及其衍生物的細(xì)胞工廠。綜上,大腸桿菌更有潛力作為4-羥基異亮氨酸高效從頭的底盤細(xì)胞。

5 展望

近年來,隨著系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)、代謝工程以及酶工程的飛速發(fā)展,包括4-羥基異亮氨酸在內(nèi)的多種高附加值氨基酸及其衍生物實(shí)現(xiàn)了高效生物合成。盡管如此,其合成潛力和合成效率仍有望進(jìn)一步提升。今后的工作可聚焦于如下方面：(1)綜合利用生物信息學(xué)、計算生物學(xué)、酶工程等技術(shù)設(shè)計性狀優(yōu)良的關(guān)鍵酶和啟動子,并通過途徑模擬遴選出最佳候選代謝途徑；(2)整合系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)、代謝工程等理論和技術(shù)重構(gòu)代謝網(wǎng)絡(luò),優(yōu)化代謝流分布；(3)運(yùn)用多組學(xué)手段及代謝流定量分析,結(jié)合生產(chǎn)菌株代謝特性,進(jìn)一步挖掘影響產(chǎn)物高效合成的限制因素,優(yōu)化代謝途徑和發(fā)酵條件。