基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質譜分析酸橙果實中的生物活性成分

酸橙(Citrus aurantium L.)為蕓香科柑橘屬植物,廣泛分布于浙江、四川、湖南、江西、福建等省份,可被用于香料、果汁和膳食營養(yǎng)補充劑的加工;在傳統中藥中,酸橙可作為枳實或者枳殼,治療消化不良和脹氣[1]?，F代藥理學研究表明酸橙具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抑菌[4]和防止動脈粥樣硬化[5]等功效,其良好的健康效應與類黃酮、生物堿、類檸檬苦素等多種生物活性成分密切相關。

目前對于酸橙的研究較少且主要集中在其枳殼與枳實中的化學成分以及藥理學方面,鄧可眾等[6]利用高效液相色譜建立了酸橙果實類藥材中8種類黃酮和3種香豆素類化合物的定量分析方法。ANA等[7]利用UPLC-PDA-ESI-MS對酸橙中的9種酚類化合物(5種類黃酮和4種酚酸)進行了分析鑒定。張棟健等[8]通過UPLC-QTOF-MS/MS分析了發(fā)酵炮制過程對于枳殼中類黃酮和檸檬苦素成分的影響。以上研究僅集中于酸橙中的某一類生物活性成分,或者某一種酸橙品種的生物活性成分,難以反映藥效物質基礎。有研究表明,不同品種及不同部位中含有的生物活性成分往往存在較大差異[9],有必要對不同品種及不同部位酸橙果實的生物活性成分進行系統研究。從而為酸橙的質量評價和藥效物質基礎研究提供實驗依據,并為酸橙資源的綜合利用奠定基礎。

本文基于本實驗室前期建立的快速且能同時篩查柑橘中生物活性物質的超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質譜的方法,同時結合數據庫、標準品和相關文獻對6個不同品種以及不同部位的酸橙生物活性物質進行靶向和非靶向高分辨率篩查,以期為酸橙資源的綜合利用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

2020年12月于中國農業(yè)科學院柑桔研究所國家果樹種質資源(重慶)柑橘圃采集6個品種的酸橙果實,包括小葉酸橙(XY)、代代酸橙(DD)、萬木橙(WM)、蚌柑(BG)、摩洛哥酸橙(MLG)、黃皮酸橙(HP)。在各個方向上采集發(fā)育良好、無病蟲害、處于成熟期的酸橙果實(圖1)。

S1-小葉酸橙；S2-代代酸橙；S3-萬木橙；S4-蚌柑；S5-摩洛哥酸橙；S6-黃皮酸橙(下同)

圖1 六種酸橙果實的樣品圖

Fig.1 Pictures of six kinds of sour orange fruits

甲酸(色譜純),上海吉至生化科技有限公司。本研究共使用95種標準物質,包括46種類黃酮、9種酚酸、3種類檸檬苦素、8種生物堿、29種香豆素。新北美圣草苷、5-降甲基蜜桔黃素、甲基橙皮苷、地奧司明、香葉木素、香蒲新苷等,成都克洛瑪生物科技有限公司；花椒毒醇、白當歸素、珊瑚菜素、蛇床子素、根皮苷、異槲皮苷、槲皮素、異橙黃酮、水仙苷等,上海源葉生物技術有限公司；辛弗林、N-甲基酪胺、香檸檬亭,美國ChromaDex；甲醇和乙腈(色譜純)、苯腎上腺素、大麥芽堿、酪胺和橙皮油內酯,美國Sigma-Aldrich；章魚胺,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。所有標準品純度均大于95%以上,具體標準品信息參照龐雯輝等[10]的文獻。

1.2 儀器

KQ5200DE超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q AdvantageA10超純水系統,美國Millipore；3K15離心機,美國Sigma-Aldrich；PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g),瑞士梅特勒-托利多公司；有機相針式濾器(13 mm,0.22 μm),上海安譜實驗科技股份有限公司；Acquity UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱,美國Waters公司；Nexera X2 UPLC超高效液相色譜,日本島津公司；SCIEX X500R QTOF四極桿串聯飛行時間高分辨質譜儀,美國AB SCIEX公司。

1.3 樣品準備

樣品采摘后用去離子水洗凈擦干。參照GB/T 8210—2011《柑桔鮮果檢驗方法》樣品前處理方法。

分別稱取5.0 g鮮重樣品(果皮、果肉、果汁)于50 mL離心管中,加入10 mL甲醇,其中果肉加入5 mL甲醇,超聲提取30 min(25 ℃,200 W),轉速為10 000 r/min,離心5 min,取上清液置于50 mL離心管中。上述提取和離心步驟再重復3次后,合并上清液,并用甲醇定容到50 mL,果肉定容到25 mL,將上述提取液用0.22 μm微孔有機濾膜過濾后放置于進樣小瓶,上機檢測。

1.4 UPLC-Q-TOF-HRMS測定

本研究采用IDA模式在正、負2種離子模式下,通過AB SCIEX X500R QTOF高分辨四極桿串聯飛行時間質譜儀采集質譜數據。色譜質譜條件采用龐雯輝等[10]的方法進行實驗。

1.5 數據分析

將UPLC-Q-TOF-HRMS數據平臺采集得到的數據信息導入SCIEX OS軟件,建立未知化合物的鑒定流程,設立偏差值為5.0×10-6,匹配得分>80,對原始數據進行峰提取和峰對齊,并將提取得到的色譜峰進行分子式擬合,結合中草藥數據庫和SCI Finder數據庫、標準品和相關文獻進行對比,從而進行化合物的分析與鑒定,采用Origin 2017繪制總離子色譜圖和層次聚類熱圖。

2 結果分析

2.1 酸橙果皮的總離子色譜圖

使用UPLC-Q-TOF-HRMS系統對6種酸橙品種的果皮、果肉以及果汁的甲醇提取物進行分析。共鑒定出化合物84種,包括類黃酮44種,酚酸8種,類檸檬苦素2種,香豆素22種,生物堿8種。圖2為正負離子模式下6個酸橙品種的果皮提取液的色譜圖。

圖2 六種酸橙果皮總離子圖

Fig.2 Total ion chromatogram of the peel of six kinds of sour orange

通過比較色譜出峰可以發(fā)現,正負離子模式下,6種果皮提取液的色譜峰型和出峰數量具有一定的差異,表明不同酸橙品種的生物活性成分存在差異。

2.2 化合物的鑒定及裂解規(guī)律

2.2.1 類黃酮

類黃酮是柑橘中十分重要的多酚類化合物,影響柑橘水果的色澤和風味。其基本骨架為C6—C3—C6,根據取代基的不同,可分為黃酮、花青素、黃烷酮、黃酮醇等[11]。不同類型的黃酮苷元和黃酮糖具有特征的裂解模式,黃酮苷元容易發(fā)生中性丟失(糖基、—CH3、—CO、—H2O、—CH2O等自由基的丟失),或在苷元位置發(fā)生逆-狄爾斯-阿爾德反應(retro-Diels-Alder,RDA)裂解重排,產生特征碎片離子。黃酮糖苷包括O-糖苷、C-糖苷,其裂解模式存在差異。類黃酮-O-糖苷的特征碎片主要表現為糖苷鍵斷裂從而丟失糖基形成苷元,常見丟失的離子碎片包括162 Da的葡萄糖,308 Da的O-二糖基,470 Da的O-三糖基等。然而類黃酮-C-糖苷不容易發(fā)生糖基脫落,而產生交叉環(huán)切除現象,正離子模式下產生[M+H-nH2O]+和[M+H-CH2O-2H2O]+等。負離子模式下產生[M-H-150]-、[M-H-120]-、[M-H-90]-和[M-H-60]-等常見的二級碎片。對于多甲氧基黃酮而言,優(yōu)先發(fā)生中性丟失—CH3(15 Da),—CO(28 Da)等,或在C環(huán)上發(fā)生RDA裂解重排,可根據碎片判斷取代基數目和種類。按照上述的裂解規(guī)律,根據標準品和相關文獻比對靶向篩查鑒定了38種類黃酮,并通過相關文獻比對和數據庫匹配對其余6種類黃酮進行了非靶向鑒定篩查?，F描述非靶向篩查鑒定過程：化合物11,在ESI-模式下,準分子離子峰m/z為447.11[M-H]-,通過分子擬合該化合物的分子式為C21H20O11,二級質譜中,脫去18 Da的H2O形成m/z為429.10[M-H-H2O]-,同時,二級碎片m/z分別為357.062 和m/z 表明從準分子離子峰[M-H]-中分別丟失了C3H6O3(90 Da),C4H8O4(120 Da)以及C5H10H5(150 Da),其為典型的類黃酮-C-糖苷。結合文獻[12],初步推斷其為異葒草素,該化合物在酸橙中首次報道。

化合物16,在ESI-模式下,準分子離子峰m/z為289.069 2[M-H]-,通過分子擬合該化合物分子式為C15H12O6。二級質譜中,產生碎片離子為和根據數據庫及相關文獻[13],初步推斷該化合物為圣草酚。同理可以推斷出化合物17和21分別為木犀草素和異鼠李素[14]。

化合物78,在ESI-模式下,準分子離子峰m/z為461.114 0[M-H]-,經過分子擬合該化合物分子式為C22H22O11。二級質譜中,分別失去一分子的C3H6O3、C4H8O4、162 Da的葡萄糖產生二級碎片離子m/z為和m/z為以及m/z為298.047 3的[Y0-H]-,說明其化合物為六碳糖,含有1個葡萄糖基。結合相關文獻[15],初步推斷該化合物為木犀草素-3-甲氧基-6-C-葡萄糖苷,此化合物在酸橙中首次報道。

化合物83,在ESI-模式下,準分子離子峰m/z為343.082 1[M-H]-。二級質譜中,連續(xù)經過脫去15 Da的CH3、28 Da的CO,產生特征碎片離子m/z分別為328.059 3的[M-H-CH3]-、313.035 4[M-H-2CH3]-、298.011 9[M-H-2CH3-CO]-,或發(fā)生RDA裂解重排后,失去—C2H2O產生m/z為163.002 7(0,4B--C2H2O),通過與數據庫對比和文獻[16]對比,初步推斷該化合物為異澤蘭黃素,該化合物在酸橙中首次報道。

2.2.2 酚酸

酚酸類化合物是具有一個羧酸基團的酚類化合物,主要以酰胺、酯或糖苷鍵的結合方式存在。分為基本骨架為C6—C3肉桂酸型和基本骨架為C6—C1苯甲酸型及其衍生物[17]。在二級質譜裂解過程中,容易丟失小分子基團如CO2,H2O,CH3,HCOOH等,產生[M-H-44]-、[M-H-18]-、[M-H-15]-、[M-H-46]-的碎片離子[18]。本實驗在ESI-離子模式下共鑒定了8種酚酸,其中6種酚酸根據標準品和數據庫靶向篩查進行鑒定。化合物71和72在ESI-模式下,準分子離子峰m/z均為353.089[M-H]-,二者在二級質譜裂解的規(guī)律基本一致,其主要的結構區(qū)別在于咖啡酸處于C—3位和C—5位。因此,可以根據不同的離子峰強度差異用于推斷咖啡酸在奎寧酸上的取代位置。二級質譜中,其特征碎片離子m/z 191.057[M-H-C9H6O3]-、179.034 8[M-H-C7H10O5]-以及135.045 1[M-H-C7H12O6-CO2]-,通過標準品、數據庫與文獻[19]對比初步鑒定化合物71和72分別是綠原酸和新綠原酸。

2.2.3 生物堿

生物堿類是一類含氮堿性有機化合物,具有旋光性[20]。不同種類的生物堿的裂解規(guī)律往往存在差異,如麻黃堿類易發(fā)生脫水作用后產生穩(wěn)定的共軛結構,然后在苯環(huán)的附近,以N原子為中心,沿側鏈朝苯環(huán)方向逐步丟失甲基取代基,再進一步脫去氨基；異喹啉生物堿類易發(fā)生α裂解,然后失去CH2N—CH3或—NH2CH等片段。本實驗在ESI+模式下,共鑒定了8種生物堿,其中4種生物堿化合物通過標準品和數據庫鑒定而來。此外,其余4種生物堿鑒定過程如下：

化合物2,ESI+模式下,準分子離子峰m/z為144.100 9[M+H]+,經過分子擬合,分子式為C7H13NO2,其特征碎片離子m/z為84.080 5[M+H-COOH-CH3]+以及質譜響應值較高的碎片58.064 7(CH3CH2 N),后者為典型的季胺堿類生物堿的裂解特征。通過結合Sci Finder數據庫并查閱相關文獻[21],初步鑒定該化合物為水蘇堿。按照同樣的方法,鑒定化合物1為六氫吡啶羧酸。

化合物4,ESI+模式下,準分子離子峰m/z為268.104 0[M+H]+,分子擬合式為C10H13N5O4,丟失了1分子132 Da的呋喃核糖殘基產生碎片離子m/z 136.061 8[M+H-C5H8O4]+特征離子碎片。根據數據庫和相關文獻[22]對比,初步推斷該化合物為腺苷。

化合物8,ESI+模式下,準分子離子峰m/z為611.752 1[M+H]+,分子擬合式為C37H42N2O6,在二級質譜中,二級碎片離子m/z分別為580.026 7[M+H-NH2CH2]+、568.785 2[M+H-CH2N—CH3]+、475.122 1[M+H-C9H12O]+的特征離子碎片,根據數據庫和相關文獻[23]推斷該化合物為異蓮心堿,此化合物在酸橙中首次報道。

2.2.4 類檸檬苦素

類檸檬苦素是一類高度含氧的三萜類物質,主要以2種形式存在,一種是游離糖苷的形式,主要存在于柑橘種子中,另一種是以β-D-葡萄糖苷類形式,主要存在于柑橘果皮和果肉中[24]。酸橙中類檸檬苦素的種類較少,本實驗僅篩查到2種類檸檬苦素,根據標準品比對,化合物68和69分別被鑒定為檸檬苦素和諾米林。

2.2.5 香豆素

香豆素指含有苯駢α-吡喃酮母核的肉桂酸型衍生物,具有芳香氣味。根據取代基不同分為4大類：簡單香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素以及其他香豆素[25]。盡管香豆素環(huán)上的取代位點和取代基不同,但它們的斷裂模式具有一定的規(guī)律。香豆素的基本骨架很難被裂解,主要通過丟失—CH3、—CO、—CO2和H2O等小分子基團來產生碎片離子。本實驗共鑒定了22種香豆素,其中20種香豆素根據標準品和相關文獻鑒定。

化合物64在ESI+模式下,準分子離子峰m/z為203.033 8[M+H]+,二級質譜中,連續(xù)丟失28 Da的CO,分別產生m/z為175.042 9[M+H-CO]+和m/z 147.044 1[M+H-2CO]+的碎片離子。再失去17 Da的OH產生m/z 131.049 7的[M+H-2CO-OH]-。根據數據庫和相關文獻[26],推斷該化合物為花椒毒酚。

化合物47,ESI+模式下,準分子離子峰m/z為293.05的[M+H]+連續(xù)丟失—CO和—CH3,其碎片離子m/z 133.027[M+H-CO2-CH3]+,同時,失去CH3產生m/z 178.025的[M+H-CH3]+,繼續(xù)失去CO產生m/z 150.030 Da的[M+H-CH3-CO]+和m/z 122.038 7的[M+H-CH3-2CO]+。根據數據庫和相關文獻[27],推斷該化合物為異東莨內酯。

2.3 酸橙中生物活性成分的分布

在生物活性成分種類方面,如附表1所示,本研究共鑒定了84種生物活性成分,包括44種類黃酮、8種酚酸、22種香豆素、2種類檸檬苦素、8種生物堿,其中小葉酸橙、代代酸橙、萬木橙、蚌柑、摩洛哥酸橙和黃皮酸橙分別篩查鑒定出72、71、68、71、71和66種生物活性成分。6個酸橙品種類黃酮種類篩查鑒定排序如下：小葉酸橙(41種)>代代酸橙(40種)>摩洛哥酸橙(39種)=蚌柑(39種)>萬木橙(38種)>黃皮酸橙(33種)。44種類黃酮中,包括12種黃酮、14種多甲氧基黃酮、3種黃酮醇、15種黃烷酮。其中29種類黃酮在6個酸橙品種中均有檢出,分別為9種黃酮(異葒草素、木犀草素、香葉木素、牡荊素等),9種多甲氧基黃酮(桔皮素、川陳皮素等),10種黃烷酮(新橙皮苷等)以及1種黃烷醇(香蒲新苷)。而牡荊素-2-O-鼠李糖苷僅小葉酸橙和黃皮酸橙中檢出。3,4,7,8-四甲氧基黃酮、甜橙黃酮等6種多甲氧基黃酮在黃皮酸橙中未檢出,而在其他品種中均有檢出。8種酚酸中,D-奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、芥子酸等8種酚酸均在6個酸橙品種的果皮中檢出。8種生物堿中,六氫吡啶羧酸、水蘇堿、辛弗林、腺苷、苯腎上腺素、N-甲基酪胺均在6個酸橙品種的不同部位均有檢出。大麥芽堿、異蓮心堿在小葉酸橙、代代酸橙、蚌柑和摩洛哥酸橙的果皮、果肉均有檢出,而在4種酸橙的果汁中,大麥芽堿均有檢出,異蓮心堿未能檢出。6個酸橙品種中均能篩查鑒定出檸檬苦素和諾米林。22種香豆素中,其中黃皮酸橙中鑒定出17種香豆素,而其余5種酸橙品種中均鑒定出13種香豆素。蛇床子素、花椒毒酚等8種香豆素在6個酸橙品種均有檢出。歐前胡素、珊瑚菜素、8-氧甲基異歐前胡內酯、異茴芹內酯、水合氧化前胡素、濱蒿內酯、白當歸素等僅在黃皮酸橙中有檢出,而橙皮內酯水合物、橙皮內酯、6′,7′-二羥基香檸檬亭、6′,7′-環(huán)氧香檸檬僅在其余5種酸橙中檢出。橙皮油內酯僅在萬木橙和黃皮酸橙中檢出,香柑醇僅在小葉酸橙、代代、蚌柑以及摩洛哥酸橙中檢出。余柳儀等[26]從代代酸橙的花、莖、葉、果實中檢測出了19個黃酮類化合物、12個多甲氧基黃酮、4個香豆素化合物、11個生物堿以及檸檬苦素,所檢出的9種黃烷醇、9種多甲氧基、4種香豆素、3種生物堿及檸檬苦素與本研究一致。而在余柳儀的研究中未檢測到大麥牙堿、異鼠李素-3-O-橙皮苷、諾米林等多種物質,本研究中均能檢出。

在生物活性成分相對含量方面,如圖3所示,對6個不同的酸橙品種以及果實不同部位中類黃酮、酚酸、生物堿、類檸檬苦素、香豆素的果皮峰面積進行層次聚類分析。因各品種果皮的生物活性物質種類最為豐富,因此以果皮為代表進行分析。不同酸橙品種的類黃酮、酚酸、生物堿、類檸檬苦素、香豆素的代謝具有多樣性。代代酸橙和蚌柑的代謝積累模式接近,因此這2個品種在聚類分析中被歸為一類,這2種酸橙依次與小葉酸橙、萬木橙、摩洛哥酸橙、黃皮酸橙聚類之后組成更高的分類單元,后4種酸橙代謝物積累模式差異很大。黃皮酸橙的含量明顯高于其他酸橙品種,如歐前胡素、珊瑚菜素、8-氧甲基異歐前胡內酯、異茴芹內酯、水合氧化前胡素、濱蒿內酯、白當歸素。結合附表1篩查鑒定結果,這些成分僅僅存在于黃皮酸橙中,因此可認為是區(qū)別于其他品種的特征成分。萬木橙中異槲皮苷、橙皮油內酯、檸檬苦素、傘形花內酯、芥子酸、新綠原酸、甜橙黃酮等12種多甲氧基黃酮含量明顯高于其他酸橙品種。對于不同部位酸橙果實的類黃酮、酚酸、生物堿、香豆素、檸檬苦素的相對含量層次聚類研究發(fā)現,酸橙中果皮、果肉、果汁這3個部位的代謝具有組織特異性,其在果肉和果汁中的積累模式接近,而果皮中生物活性成分含量明顯高于果肉和果汁。據相關文獻報道,酸橙品種遺傳的多樣性與過氧化物同工酶、GOT等位基因、不同染色體上的單拷貝基因序(single-copy nuclear gene,SCNGS)等相關,表明酸橙具有復雜的遺傳背景[28]。何發(fā)[29]基于SSR技術分析酸橙的起源,發(fā)現酸橙的親本來源于柚和寬皮柑橘,在此基礎上,柳俊杰[30]基于全基因組測序進行了不同品種的酸橙非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚類分析,表明黃皮酸橙為寬皮柑橘和宜昌橙的雜交品種,不屬于酸橙純種,而代代保留最原始的親本柚的基因組信息,可為不同酸橙品種代謝物積累模式的多樣性提供一定的參考。

a-不同品種酸橙果皮的生物活性成分相對含量；b-酸橙果實不同部位中生物活性成分相對含量

圖3 類黃酮、酚酸、類檸檬苦素、生物堿和香豆素類化合物在不同酸橙品種和組織中的積累規(guī)律

Fig.3 Accumulation patterns of flavonoids,phenolic acids,limonoids,alkaloids and coumarins in different sour orange fruit species and tissues

注：圖中物質的相對含量進行了歸一化處理；由圖例所示,從紅到藍依次遞減

3 結論

本實驗使用UPLC-Q-TOF-HRMS技術并采用靶向和非靶向篩查相結合的方法,對6個酸橙品種中的84種生物活性成分進行了分析和鑒定,包括44種類黃酮、8種酚酸、22種香豆素、2種類檸檬苦素、8種生物堿。其中,35種生物活性成分在酸橙中首次報道,此研究進一步豐富了酸橙生物活性成分的數據庫。小葉酸橙、代代酸橙、萬木橙、蚌柑、摩洛哥酸橙和黃皮酸橙分別篩查鑒定出72、71、68、71、71和66種生物活性成分。通過對84種生物活性成分的果皮峰面積層次聚類分析,研究發(fā)現黃皮酸橙果皮中有區(qū)別于其他酸橙品種的特征成分,如歐前胡素、珊瑚菜素、8-氧甲基異歐前胡內酯、異茴芹內酯、水合氧化前胡素、濱蒿內酯、白當歸素等。同時發(fā)現果皮中所含有的生物活性成分的種類和數量遠多于果汁和果肉中。此研究為酸橙的深加工和其中含有的多種生物活性成分的綜合利用提供理論依據。