桉木預水解液中半纖維素多糖分離純化及抗氧化活性研究

作者：李學秀劉海棠安永貞劉婧陳琳金鑫來源：《中國造紙》日期：2022-04-25人氣：1404

隨著黏膠纖維以及纖維制品需求量的不斷增加，未來幾年內用于生產再生纖維的溶解漿產量也日益增多^[1]。在生產溶解漿過程中會產生大量的預水解液，如何對預水解液進行合理利用成為當前研究熱點。預水解液中半纖維素含量豐富，其他如木素、糠醛等含量較少，因此利用半纖維生產高附加值產品可實現(xiàn)預水解液的有效利用^[2]。

在預水解液半纖維素進行高附加值利用時，預水解液中的雜質會阻礙其有效利用，因此需要對半纖維素進行分離和純化^[3]。離子交換柱層析法在多糖的純化中應用十分廣泛^[4]，離子交換柱層析常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂。其機理主要是利用物質所帶正負電荷的差異對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，通過改變淋洗液的離子強度和pH值，使得不同性質的多糖依次從層析柱中分離出來^[5]。半纖維素在眾多領域均具有潛在的應用前景^[6]，Anmad等人^[7]從車前子殼中分離出阿拉伯聚木糖，以此為原料制備出了抗菌薄膜。陳婷等人^[8]對桉木堿性過氧化性機械漿（APMP）廢液中的半纖維素進行改性后發(fā)現(xiàn)其具有一定的生物活性。汪心娉等人^[9]報道稱使用低共熔溶劑選擇性處理玉米秸稈，可將其中的半纖維素轉化為低聚木糖。但是有關預水解液半纖維素多糖分離純化和結構分析的研究報道較少。

本研究通過對半纖維素粗多糖分離純化得到純化多糖，對其單糖成分、結構表征及體外抗氧化活性進行研究，以期對預水解液的進一步研究奠定理論基礎。

1 實　驗

1.1　材料及試劑

桉木預水解液（PHL），山東太陽紙業(yè)股份有限公司；濃硫酸、氯化鈉、無水乙醇，分析純，天津市江天化工技術有限公司；無水甲醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司；DEAE-650M，生化試劑，TOSOH公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等，色譜純，Sigma公司。

1.2　實驗儀器

7000B氣質聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任；N-1100旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；H3021D高速離心機，上海知信實驗儀器技術有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；1530VP掃描電子顯微鏡，德國LEO公司。

1.3　實驗方法

1.3.1　預水解液糖組分分析

桉木預水解液原樣以及酸水解后的預水解液經離心機（8000 r/min，15 min）離心除雜，過0.22 μm濾膜后稀釋到一定濃度，用高效陰離子交換色譜儀測定糖含量。

1.3.2　半纖維素粗多糖的制備

將離心除雜后的桉木預水解液原樣進行旋轉蒸發(fā)濃縮，使用濃硫酸酸化預水解液至pH值2.0，除去木素，靜置過夜。取上清液以體積比1∶4的比例加入無水乙醇沉淀（使無水乙醇含量達到80%），靜置24 h，8000 r/min離心15 min，收集沉淀物，真空冷凍干燥獲得半纖維素粗多糖（PHLP）。

1.3.3　半纖維素粗多糖的分離純化

將PHLP配制成濃度為1 mg/mL的溶液，取20 mL溶液加樣至DEAE-650M陰離子交換層析柱，依次用蒸餾水、0.2、0.4、0.6 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，每個梯度洗脫100管。使用收集器收集，每管收集5 mL。采用苯酚-硫酸法^[10]檢測各管的多糖含量。洗脫曲線的橫坐標為洗脫管數(shù)，縱坐標為測定的多糖含量。將洗脫曲線中各峰對應管數(shù)的洗脫液合并，對收集的洗脫液減壓濃縮后用去離子水透析除鹽。透析完全后進行真空冷凍干燥即得到純化后的2種多糖PHLP-1和PHLP-2。

1.3.4　葡萄糖醛酸含量測定

釆用硫酸-咔唑法測定^[11]葡萄糖醛酸含量。精確稱取干燥至恒質量的葡萄糖醛酸50 mg，用蒸餾水溶解，定容于100 mL容量瓶中。分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL濃度為0.5 mg/mL的葡萄糖醛酸溶液于試管中，分別補加水至1 mL，在冰水浴中加入6 mL濃硫酸?；靹蚝螅?5℃下水浴20 min，冷卻至室溫，每管加入0.2 mL咔唑溶液（1 g/L，用無水乙醇配制）。室溫下保持2 h，在530 nm下測定吸光度。以葡萄糖醛酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。葡萄糖醛酸溶液標準曲線見圖1。按上述操作步驟測定吸光度，從而計算葡萄糖醛酸濃度。

圖1 葡萄糖醛酸溶液標準曲線

Fig. 1 Standard curve of glucuronic acid solution

1.3.5　單糖組分測定

1.3.5.1　標準單糖的衍生化^[12]

分別配置1 mg/mL的各單糖標準溶液，包括葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖及半乳糖放入試管中。分別取0、40、80、100、250、500 μL單糖凍干。在凍干后的標準單糖樣品中，分別加入50 μL濃度為20 mg/mL的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液，40℃水浴80 min后加入80 μL的N,O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA），混勻，40℃水浴80 min，然后在10000 r/min下離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后置于進樣瓶，進行氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）分析。

1.3.5.2　純化后的多糖水解及衍生化^[13]

稱取2 mg多糖于反應釜中，加入5 mL三氟乙酸（2 mol/L 三氟乙酸（TFA）），密封后120℃水解2 h，之后加入無水甲醇旋蒸除去殘留TFA，最后加入2 mL去離子水，混勻，取100 μL混合液于新的離心管中，真空冷凍干燥。按照1.3.5.1標準單糖的衍生化方法處理，反應產物進行氣質分析。

1.3.5.3　氣相色譜-質譜聯(lián)用分析條件

色譜柱為HP-5氣相色譜柱（30 cm×0.32 mm×0.25 μm）；進樣口溫度設定為250℃，檢測器溫度設定為240℃，流速1 mL/min；升溫程序：初始溫度為110℃，保持2 min，以8℃/min速率升到160℃，再以2℃/min速率升到230℃，最后以5℃/min的速率升到250℃，保持2 min。載氣為氮氣，進樣量為1 μL，分流比為10∶1。

1.3.6　紅外光譜（FT-IR）測定

稱取純化后的多糖至瑪瑙研缽中，按照1∶100的比例加入干燥后的溴化鉀做分散劑，研磨成微細粉末，然后置于模具中，以10 MPa 壓力壓制1 min制片，進行紅外光譜測定。光譜掃描范圍400~4000 cm^-1，掃描32次，分辨率為4 cm^-1，掃描時扣除H₂O和CO₂的背景。

1.3.7　掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

在金屬樣品臺上粘貼一塊導電膠用于固定樣品，取適量純化后的多糖樣品置于導電膠上，用洗耳球輕輕吹去浮樣，將金屬樣品臺放入離子濺射裝置中鍍一層導電金膜，鍍膜后用1530VP掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.3.8　PHLP抗氧化活性分析

1.3.8.1　DPPH自由基清除活性測定

參考馮炘等人^[14]的方法稍作修改，具體步驟為：取不同濃度的多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）和VC溶液與1 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L）混合均勻，避光反應30 min后測定517 nm下的吸光度。以VC為陽性對照。按計算1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率。

\begin{array}{l}  \end{array}

式中，A₁為實驗組吸光度；A₂為樣品本底吸光度；A₀為空白組吸光度。

1.3.8.2　ABTS自由基清除活性測定

參考XU等人^[15]的方法稍作修改，具體為：取2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）溶液（7.4 mmol/L）30 mL于50 mL離心管中，加入30 mL過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L），混合均勻，避光反應12 h。然后用蒸餾水稀釋，使其在734 nm下的吸光度約為0.7±0.02，制成ABTS反應液。取1 mL不同濃度的多糖溶液和VC溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）與4 mL ABTS反應液混合均勻，靜置10 min后測定734 nm下的吸光度。以VC為陽性對照。按計算ABTS自由基清除率。

\begin{array}{l}  \end{array}

式中，B₁為實驗組吸光度；B₂為樣品本底吸光度；B₀為空白組吸光度。

1.3.8.3　O₂^-自由基清除活性測定

參考DONG等人^[16]的方法。具體為：取4.5 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH值=8.2，50 mmol/L）于試管中，加入1 mL不同濃度的多糖溶液和VC溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL），加入0.3 mL經25℃水浴后的鄰苯三酚溶液（10 mmol/L，以10 mmol/L HCl配制）。迅速搖勻后，25℃水浴5 min，然后加入1 mL HCl（8 mmol/L）終止反應，在320 nm處測定吸光度。以VC為陽性對照。按計算O₂^-自由基清除率。

O ? 2 自 由 基 清 除 率 = (1 ? C 1 ? C 2 C 0) \times 100 %

（3）

式中，C₁為實驗組吸光度；C₂為樣品本底吸光度；C₀為空白組吸光度。

1.3.8.4　OH^-自由基清除活性測定

參考CHEN等人^[17]的方法稍作修改，具體為：取不同濃度的多糖溶液及VC溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）于試管中，依次加入1 mL FeSO₄溶液（5 mmol/L）、1 mL水楊酸-乙醇溶液（5 mmol/L），最后加入1 mL H₂O₂溶液（5 mmol/L），混合均勻后，在37℃下水浴30 min。在510 nm處測定吸光度，VC為陽性對照。按計算OH^-自由基清除率。

O H ? 自 由 基 清 除 率 = (1 ? D 1 ? D 2 D 0) \times 100 %

（4）

式中，D₁為實驗組吸光度；D₂為樣品本底吸光度；D₀為空白組吸光度。

2 結果與討論

2.1　預水解液糖組分分析

表1為預水解液中糖組分的含量。由表1可知，預水解液中單糖主要有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，其中以木糖為主，占單糖含量的57.6%。聚糖以聚木糖為主，占聚糖含量的65.7%。

2.2　PHLP分離純化分析

在陰離子交換層析柱中，氯化鈉溶液中的陰離子（氯離子）將會與吸附在填料上的多糖競爭，而使用蒸餾水和不同濃度的氯化鈉溶液洗脫則可以達到分離多糖的目的。

以DEAE-650M離子交換層析柱對PHLP進行分離純化，得到洗脫曲線如圖2所示。由圖2可以看出，經蒸餾水、0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl溶液洗脫后，有3個洗脫峰。第1個洗脫峰是經蒸餾水洗脫出來的，因為這一部分糖對填料的親和力較小，吸附能力較弱，所以最先被洗脫出來^[18]；而另外擁有較強吸附能力的糖組分則隨著洗脫液中陰離子的逐漸增多被洗脫下來，得到第2個洗脫峰，當用0.4 mol/L的NaCl洗脫時出現(xiàn)了較小的洗脫峰，因其糖含量較少沒有純糖的必要，故不再進行收集。以蒸餾水和0.2 mol/L NaCl溶液作為洗脫液洗脫下的多糖，分別為PHLP-1中性糖和PHLP-2酸性糖^[19]。測定PHLP-1的得率為33.9%，PHLP-2的得率為25.5%。PHLP-1和PHLP-2的葡萄糖醛酸含量分別為0.0057、0.081 mg/mL，PHLP-2的糖醛酸含量明顯高于PHLP-1，這與洗脫液鹽濃度的增加可能有極大的關系，氯化鈉溶液濃度越高，洗脫下來的多糖側鏈所帶酸根基團越多，多糖的酸性也就越強^[20]。

圖2 多糖的DEAE-650M洗脫曲線

Fig. 2 Elution curve of crude polysaccharides on DEAE-650M

2.3　氣相色譜-質譜聯(lián)用分析

因糖類物質的極性較大，難以汽化，因此在使用氣質聯(lián)用分析多糖時，需要對糖進行衍生化處理，使其成為易于汽化的衍生物。本研究采用硅烷化法對5種單糖標準品進行衍生化，然后進行GC-MS分析，結果如圖3和圖4所示。從圖3和圖4可以看出，從PHLP-1、PHLP-2中檢測出5種單糖：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖，其摩爾比分別為0.09∶1∶0.13∶0.07∶0.35和0.1∶1∶0.03∶0.09∶0.08。

圖3 單糖標準品的GC-MS色譜圖

Fig. 3 GC-MS chromatogram of monosaccharide standard

圖4 多糖PHLP-1、PHLP-2的GC-MS色譜圖

Fig. 4 GC-MS chromatogram of polysaccharides of PHLP-1, PHLP-2

2.4　紅外光譜測定

圖5為PHLP-1和PHLP-2的FT-IR圖。如圖5所示，PHLP-1和PHLP-2具有多糖的典型吸收帶。3400 cm^-1處為羥基伸縮振動峰，由多糖分子內或分子間的—OH伸縮振動引起；2923 cm^-1處是C—H鍵的伸縮振動吸收峰；在PHLP-2中，1735 cm^-1處出現(xiàn)了1個弱吸收峰，是由酯羰基（COOR）伸縮振動引起的，1600 cm^-1處共有的強峰為羧酸酯振動峰，是由—COO—的伸縮振動引起，說明分子含有糖醛酸，表明PHLP-2是酸性多糖^[21]；1400 cm^-1處的中強峰代表羧基的存在；1120、1076、1045及620 cm^-1處出現(xiàn)的振動峰，是由吡喃糖的C—O—C的特征骨架振動造成的^[22]；900 cm^-1處的振動吸收峰，代表2個多糖是以β-糖苷鍵連接的^[23]；但840 cm^-1處左右有較弱的吸收信號，證明PHLP-1中α-糖苷鍵的存在^[24]。根據(jù)結果得知，PHLP-1和PHLP-2均含有吡喃環(huán)和β-糖苷鍵，PHLP-1中含有α-糖苷鍵，PHLP-2為沒有α-糖苷鍵的酸性多糖。

圖5 PHLP-1、PHLP-2的FT-IR圖

Fig. 5 FT-IR spectra of PHLP-1 and PHLP-2

2.5　形貌分析

圖6為多糖PHLP-1、PHLP-2的SEM圖。從圖6可以看出，PHLP-1形態(tài)不一，比較雜亂；PHLP-2呈疏松的碎片狀結構，且表面比較光滑。SEM圖直觀的說明了PHLP-1和PHLP-2均呈無序雜亂的結構形態(tài)。2種多糖結構的差異性可能與其單糖組成比例不同有很大的關系^[24]。

圖6 多糖PHLP-1、PHLP-2的SEM圖

Fig. 6 SEM images of polysaeeharides from PHLP-1 and PHLP-2

2.6　抗氧化活性分析

2.6.1　DPPH自由基清除活性

DPPH自由基是一種常見的穩(wěn)定自由基，常被用于評估抗氧化劑自由基清除能力^[25]。DPPH自由基在溶液中呈現(xiàn)深紫色，并且在517 nm左右有1個強吸收帶，DPPH自由基的清除機理是抗氧化劑提供的氫和電子，可以將DPPH自由基還原為黃色，降低其在517 nm處的吸光值^[26]。圖7為PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對DPPH自由基的清除能力。由圖7可以看出，PHLP-1和PHLP-2對DPPH自由基的清除能力均隨多糖濃度的提高而增強，且呈現(xiàn)明顯的量效依賴關系。當多糖的質量濃度達到1 mg/mL時，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖的DPPH自由基清除率分別達到44.12%、47.79%和20.44%，但是它們清除DPPH自由基的能力明顯低于VC清除DPPH自由基的能力。其清除自由基能力強弱順序為VC>PHLP-2>PHLP-1>粗多糖，IC₅₀值依次為0.3×10^-5、0.553、0.603、2.204 mg/mL，IC₅₀值作為半抑制濃度，該值越小，代表自由基清除能力越強^[20]。粗多糖由于其中含有的復雜成分較多，清除DPPH自由基能力降低，影響了其抗氧化活性^[27]，因此清除能力低于PHLP-1和PHLP-2。而PHLP-2較PHLP-1的清除自由基能力強的原因是PHLP-2為酸性多糖，其糖醛酸含量較高，可以活化異頭碳上的氫原子，從而賦予其更高的抗氧化活性^[28]。

圖7 PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對DPPH自由基的清除能力

Fig. 7 DPPH radical scavenging activities of PHLP-1, PHLP-2 and crude polysaccharides

2.6.2　ABTS自由基清除活性

多糖作為供氫體可以和ABTS自由基反應，通過反應后溶液吸光度值降低的大小，從而來判斷多糖的抗氧化能力^[29]。圖8為PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對ABTS自由基的清除能力。由圖8可知，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖對ABTS自由基具有一定的清除能力，且隨著濃度的增加，清除率逐漸提高。當濃度達到1 mg/mL時，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖的清除率分別達到67.62%、71.81%和31.05%，清除ABTS自由基的能力弱于VC清除ABTS自由基的能力。PHLP-2對ABTS自由基的清除能力最好，其次是PHLP-1，它們的抗氧化能力均大于粗多糖。PHLP-2、PHLP-1、粗多糖對ABTS自由基清除濃度的IC₅₀值依次為0.580、0.669、3.721 mg/mL。有研究^[^]發(fā)現(xiàn)多糖中糖醛酸含量與自由基清除能力呈線性正相關，這與本研究的實驗結果相吻合。此外Sun等人^[32]也報道了糖醛酸含量越高的黑木耳實體多糖其清除自由基的能力也越強。

圖8 PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對ABTS自由基的清除能力

Fig. 8 ABTS radical scavenging activities of PHLP-1, PHLP-2 and crude polysaccharides

2.6.3　O₂^-自由基清除活性

O₂^-自由基是一種弱氧化劑，相比較OH^-自由基和DPPH自由基活性較弱，但其可能會與羥基分子相互結合從而造成組織損傷^[33]。圖9為PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對O₂^-自由基的清除作用。由圖9可知，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖對O₂^-自由基有一定的清除能力，但是能力較弱。在0～0.4 mg/mL之間，清除率的增長速度較慢，0.4～0.8 mg/mL之間增速稍快，并逐漸趨于穩(wěn)定。在1 mg/mL時，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖的清除率分別為28.34%、31.10%和7.71%，明顯低于同濃度下VC的清除能力。其清除O₂^-自由基能力強弱順序為PHLP-2>PHLP-1>粗多糖。PHLP-2、PHLP-1、粗多糖對O₂^-自由基清除能力的IC₅₀值依次為2.392、4.095、8145 mg/mL。O₂^-自由基的清除能力大小與多糖中O—H鍵的離解能有關，O—H鍵的離解能越強，清除O₂^-自由基的能力越低；同時多糖帶有的羧基、醛基等吸電子基團越多，則O—H鍵的能量越弱，那么清除O₂^-自由基的能力也越高^[^]。PHLP-2的O₂^-自由基清除能力比PHLP-1高，其原因可能是PHLP-2為酸性多糖，其糖醛酸含量較多，具有較弱的O—H鍵的離解能。

圖9 PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對O₂^-自由基的清除能力

Fig. 9 O₂^- radical scavenging activity of PHLP-1, PHLP-2 and crude polysaccharides

2.6.4　OH^-自由基清除活性

OH^-自由基是較為活潑的自由基之一，OH^-自由基的存在可能會引起機體生物大分子氧化受損^[36]。圖10為PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對OH^-自由基的清除作用。由圖10可知，PHLP-1、PHLP-2兩種多糖組分對OH^-自由基的清除能力均較弱。在1 mg/mL時，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖的清除率分別為20.74%、22.70%和11.68%，明顯低于同濃度下VC的清除能力。PHLP-2、PHLP-1、粗多糖對OH^-自由基清除能力的IC₅₀值依次為6.932、7.216、89.857 mg/mL。PHLP-2的OH^-自由基清除能力略強于PHLP-1，這可能是由于PHLP-2的糖醛酸含量比PHLP-1較多，糖醛酸與反應溶液中的Fe²⁺螯合減少了羥基的生成^[37]。

圖10 PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對OH^-自由基的清除能力

Fig. 10 OH^- radical scavenging activity of PHLP-1, PHLP-2 and crude polysaccharides

3 結　論

本研究采用醇沉法從桉木預水解液中提取半纖維素粗多糖（PHLP），并利用DEAE-650M離子交換柱對其進行分離純化，對純化得到的中性多糖PHLP-1和酸性多糖PHLP-2兩種組分進行分析。

3.1　單糖組分結果表明，PHLP-1和PHLP-2兩種多糖均由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖及葡萄糖組成，其摩爾比分別為0.09∶1∶0.13∶0.07∶0.35和0.1∶1∶0.03∶0.09∶0.08。

3.2　紅外光譜測定表明，PHLP-1和PHLP-2均具有多糖典型的特征吸收峰，都含有吡喃環(huán)和β-糖苷鍵，并且PHLP-1含有α-糖苷鍵，而PHLP-2為不含α-糖苷鍵的酸性多糖。掃描電子顯微鏡觀察PHLP-1和PHLP-2均呈無序雜亂的結構形態(tài)。

3.3　抗氧化結果表明，PHLP-1和PHLP-2及粗多糖對DPPH自由基和ABTS自由基均具有較強的清除能力，對O₂^-自由基和OH^-自由基的清除能力較弱，但是均呈現(xiàn)隨質量濃度的增加清除率逐漸升高的現(xiàn)象，說明PHLP-1和PHLP-2具有一定的抗氧化潛力，其中PHLP-2的抗氧化活性高于PHLP-1。

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桉木預水解液中半纖維素多糖分離純化及抗氧化活性研究

1 實 驗

1.1 材料及試劑

1.2 實驗儀器

1.3 實驗方法

1.3.1 預水解液糖組分分析

1.3.2 半纖維素粗多糖的制備

1.3.3 半纖維素粗多糖的分離純化

1.3.4 葡萄糖醛酸含量測定

1.3.5 單糖組分測定

1.3.5.1 標準單糖的衍生化[12]

1.3.5.2 純化后的多糖水解及衍生化[13]

1.3.5.3 氣相色譜-質譜聯(lián)用分析條件

1.3.6 紅外光譜（FT-IR）測定

1.3.7 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

1.3.8 PHLP抗氧化活性分析

1.3.8.1 DPPH自由基清除活性測定

1.3.8.2 ABTS自由基清除活性測定

1.3.8.3 O2-自由基清除活性測定

1.3.8.4 OH-自由基清除活性測定