果糖對(duì)多形漢遜酵母硒代謝及轉(zhuǎn)錄組的影響

富硒酵母是通過(guò)在培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉(Na2SeO3),經(jīng)過(guò)生物合成轉(zhuǎn)化獲得的有機(jī)硒含量高(1 000～2 500 mg/kg)、安全無(wú)毒,生理活性好的酵母硒補(bǔ)充劑。富硒酵母被廣泛應(yīng)用于保護(hù)心臟、治療糖尿病、抗癌、抗衰老等需要添加強(qiáng)化硒營(yíng)養(yǎng)的功能性食品、藥品、化妝品中,發(fā)展前景十分廣闊[1-3]。

果糖是一種常見(jiàn)的己酮糖,具有甜度高、升糖指數(shù)低以及滲透性好等優(yōu)點(diǎn)[4]?？狄愕萚5]發(fā)現(xiàn)使用108 g/L果糖發(fā)酵釀酒酵母時(shí),釀酒酵母的甘油產(chǎn)量最高；DANCH等[6]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加果糖可以促進(jìn)釀酒酵母對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收,但其分子機(jī)制尚不明確。

本研究以食品級(jí)多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)為出發(fā)菌株,通過(guò)對(duì)比不同碳源發(fā)酵組的酵母細(xì)胞生物量(dry cell weight,DCW)、胞內(nèi)硒代蛋氨酸(selenomethionine,Se-Met)含量,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,篩選果糖發(fā)酵組與葡萄糖發(fā)酵組之間的表達(dá)差異基因(differential expression genes,DEGs),進(jìn)而富集分析與果糖代謝及無(wú)機(jī)硒吸收代謝相關(guān)的基因通路基因,為進(jìn)一步解析果糖對(duì)多形漢遜酵母中的糖代謝和硒代謝影響的分子機(jī)制,以及優(yōu)化酵母富硒發(fā)酵工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多形漢遜酵母(Hasenula polymorpha ATCC 26012),由陜西科技大學(xué)功能微生物研究室保存。

富硒-酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基加無(wú)菌Na2SeO3母液(終濃度60 μmol/L)。

葡萄糖、D-果糖,天津科密歐公司；Na2SeO3、胰蛋白酶、硒代蛋氨酸,美國(guó)Sigma公司；TRIzol Reagent,美國(guó)Invtrogen公司；正己烷(色譜級(jí))、乙腈(色譜級(jí)),Merck公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜系統(tǒng),美國(guó)Agilent公司；NexION 300D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,美國(guó)Perkin-Elmer公司；ELX808多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多形漢遜酵母富硒發(fā)酵培養(yǎng)

菌種以YPD培養(yǎng)基復(fù)蘇,經(jīng)30 ℃、160 r/min發(fā)酵12 h,得到種子液。以10%的接種量,將種子液分別接種到葡萄糖-富硒-YPD和不同濃度的果糖-富硒-YPD(果糖含量分別為0、20、40、60、80、120、140、160、200 g/L)培養(yǎng)基中,經(jīng)30 ℃,200 r/min培養(yǎng)72 h；12～24 h間隔取樣,測(cè)定酵母DCW和Se-Met含量。

1.3.2 Se-Met的提取和含量分析[7-8]

取酵母發(fā)酵液5 mL,6 000 r/min離心10 min后,加入5 mL的30 mmol/L Tris-HCl和SiO2 beads,渦旋破碎,再加入胰蛋白酶,37 ℃孵育6 h,然后超聲30 min,10 000 r/min離心10 min,收集上清液用HPLC-ICP-MS方法檢測(cè)并計(jì)算酵母胞內(nèi)Se-Met含量。HPLC條件：色譜柱為 SB-C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm,Agilent),流動(dòng)相A(0.1%甲酸),流動(dòng)相B(乙腈),流速1.0 mL/min,洗脫程序?yàn)椋?% B～50% B,0～2 min;50% B～100% B,2～4 min;100% B,4～9 min;0% B,9～10 min。ICP-MS條件：載氣流速1.0 L/min,反應(yīng)氣體3.5 mL/min 氫氣,冷卻氣流15.0 L/min,同位素檢測(cè)硒分子量為77、78、80和82。

1.3.3 RNA提取、測(cè)序和分析

取酵母發(fā)酵液2 mL,4 ℃、6 000 r/min離心10 min,用TRIzol試劑盒提取其總RNA,送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。用Trinity軟件[9]將測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組Raw序列濾過(guò)得到Clean序列,再組裝為Unigene序列；用HTSeq方法對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)定量[10]；利用DESeq2方法[11]對(duì)比分析不同組酵母的基因表達(dá)量,以差異倍數(shù)變化超過(guò)2倍(|log2FC|>1)且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.01為標(biāo)準(zhǔn),篩選果糖發(fā)酵組和葡萄糖發(fā)酵組之間的顯著DEGs；再將DEGs比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行DEGs的GO功能和KEGG代謝通路富集[12-13],進(jìn)一步注解參與果糖代謝、硒復(fù)合物合成代謝的關(guān)鍵酶基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 果糖濃度對(duì)多形漢遜酵母生長(zhǎng)和Se-Met產(chǎn)量的影響

將H.polymorpha種子液接種含不同濃度果糖的富硒培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵,結(jié)果如圖1所示：在0～100g/L內(nèi)隨著果糖質(zhì)量濃度增加,酵母生長(zhǎng)和酵母細(xì)胞胞內(nèi)Se-Met含量呈上升趨勢(shì),而當(dāng)果糖質(zhì)量濃度>120 g/L時(shí),可能由于滲透壓過(guò)高,對(duì)H.polymorpha生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,導(dǎo)致其胞內(nèi)Se-Met產(chǎn)量降低；發(fā)酵培養(yǎng)0～12 h時(shí),各果糖濃度組的酵母DCW與Se-Met含量無(wú)顯著差異；發(fā)酵24～48 h,80和100 g/L果糖質(zhì)量濃度組的酵母DCW、Se-Met產(chǎn)量迅速增加,發(fā)酵48 h達(dá)到最高,隨后可能由于營(yíng)養(yǎng)消耗和代謝廢物積累等因素導(dǎo)致DCW、Se-Met增速減緩,甚至略有下降。

a-酵母DCW；b-酵母胞內(nèi)Se-Met產(chǎn)量

圖1 果糖濃度對(duì)多形漢遜酵母DCW和Se-Met產(chǎn)量的影響

Fig.1 Effects of fructose on DCW and Se-Met yield of H.polymorpha

2.2 果糖和葡萄糖對(duì)酵母生長(zhǎng)和Se-Met含量的影響

分別以葡萄糖為碳源作為對(duì)照組,果糖為碳源作為試驗(yàn)組,發(fā)酵培養(yǎng)48 h時(shí),80 g/L的葡萄糖組酵母的DCW最高,為(44.13±0.38)g/L；80 g/L果糖組酵母胞內(nèi)Se-Met產(chǎn)量和含量分別為(34.27±0.39)mg/L和(0.87±0.04)mg/g,均高于80 g/L葡萄糖組的(34.13±0.72)mg/L和(0.77±0.01)mg/g。結(jié)果表明在濃度相同條件下,葡萄糖有利于促進(jìn)酵母細(xì)胞生長(zhǎng),而果糖有利于酵母細(xì)胞中Se-Met的合成和積累。80與100 g/L果糖組酵母的DCW、Se-Met產(chǎn)量和含量無(wú)明顯差異,從生產(chǎn)成本綜合考慮,優(yōu)選80 g/L果糖作為發(fā)酵碳源濃度。

表1 果糖和葡萄糖對(duì)多形漢遜酵母的DCW和Se-Met的影響

Table 1 Effects of fructose and glucose on DCW and Se-Met levels of H.polymorpha

注：*P <0.05,顯著差異

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

分別取80 g/L葡萄糖發(fā)酵組(Glu組)和80 g/L果糖發(fā)酵組(Fru組)發(fā)酵48 h的培養(yǎng)液,提取總RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。利用Fast QC法分析測(cè)序質(zhì)量,結(jié)果如表2所示,Glu組獲得44 086 312和44 232 706個(gè)Clean reads,Fru組得到42 454 102和42 354 868個(gè)Clean reads,4個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄組的Q30(0.1%堿基識(shí)別錯(cuò)誤率)最小值為95.96%,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。將4個(gè)樣本Clean reads與Unigene序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果匹配率為84.21%～85.80%,表明測(cè)序樣本未受到污染。

表2 多形漢遜酵母的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

Table 2 Quality statistics of transcriptome of H.polymorpha

2.4 果糖與葡萄糖發(fā)酵組間的DEGs

用FPKM計(jì)算各基因表達(dá)量,以|lg2FC|>1且FDR<0.01作為標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果Fru組與Glu組之間有221個(gè)DEGs,其中80個(gè)DEGs表達(dá)顯著上調(diào),141個(gè)DEGs表達(dá)顯著下調(diào)(圖2),表明果糖和葡萄糖對(duì)多形漢遜酵母的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在著顯著差別。

圖2 果糖發(fā)酵組和葡萄糖發(fā)酵組之間的顯著差異表達(dá)基因

Fig.2 DEGs between the Fru group and the Glu group

2.5 果糖與葡萄糖發(fā)酵組間DEGs的GO富集分析

將Fru組和Glu組之間的221個(gè)DEGs進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),共計(jì)130個(gè)DEGs獲得GO功能注釋,其中21個(gè)DEGs富集在9個(gè)生物過(guò)程中；17個(gè)DEGs富集在11個(gè)細(xì)胞組分中；92個(gè)DEGs富集在10個(gè)分子功能中。其中富集最顯著的30個(gè)GO term包括了3個(gè)分子功能、7個(gè)細(xì)胞組分和20個(gè)生物過(guò)程,主要涉及蛋氨酸生物合成(2個(gè)DEGs)、同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶活性(2個(gè)DEGs)、糖酵解(3個(gè)DEGs)、戊糖磷酸支路(1個(gè)DEGs)、氧化還原反應(yīng)(24個(gè)DEGs)、谷氨酸生物合成(2個(gè)DEGs)和電子傳遞鏈(2個(gè)DEGs)等(圖3-a)。

2.6 果糖與葡萄糖發(fā)酵組間DEGs的KEGG代謝通路富集分析

將Fru組和Glu組之間的221個(gè)DEGs比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),共計(jì)108個(gè)DEGs被KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到52條代謝途徑中,包括5條細(xì)胞過(guò)程通路、1條環(huán)境信息處理、8條遺傳信息處理和38條代謝通路。其中富集最顯著的30條通路包括4條細(xì)胞過(guò)程、5條遺傳信息和21條代謝通路,涉及過(guò)氧化物酶體(4個(gè)DEGs)、酵母減數(shù)分裂(4個(gè)DEGs)和內(nèi)吞作用(2個(gè)DEGs)等與酵母細(xì)胞的抗氧化、生長(zhǎng)繁殖、硒攝入有關(guān)通路；糖酵解/糖異生(6個(gè)DEGs)、戊糖磷酸途徑(4個(gè)DEGs)、果糖和甘露糖代謝(3個(gè)DEGs)和N-聚糖生物合成(1個(gè)DEGs)等參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)果糖的轉(zhuǎn)化和代謝的通路；半胱氨酸和蛋氨酸代謝(5個(gè)DEGs)、硒復(fù)合物代謝(2個(gè)DEGs)和谷胱甘肽代謝(1個(gè)DEGs)等參與硒代氨基酸、硒蛋白和谷胱甘肽的代謝通路(圖3-b)。

a-GO term；b-KEGG代謝通路

圖3 果糖與葡萄糖發(fā)酵組間DEGs的GO term和KEGG代謝通路富集分析

Fig.3 Analysis of enriched GO terms and KEGG pathways of DEGs between the Fru group and the Glu group

2.7 與果糖代謝和硒代謝相關(guān)的DEGs

分析Fru組和Glu組之間的DEGs圖譜,表明在Fru組中,酵母中ECU01(EC:4.1.2.13)和MPG1(EC:2.7.7.13)顯著上調(diào),而FBP1(EC:3.1.3.11)、GAPDH1(EC:1.2.1.12)、PGK(EC:2.7.2.3)顯著下調(diào)。其中,EC:4.1.2.13催化1,6-二磷酸果糖與3-磷酸甘油醛之間的轉(zhuǎn)換頻率[14],EC:3.1.3.11催化1,6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖[15-16],EC:1.2.1.12和EC:2.7.2.3是參與催化糖酵解的關(guān)鍵酶[15,17],EC:2.7.7.13催化1-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-甘露糖和甘露聚糖的合成[18]。這些酶基因表達(dá)量的改變,可能下調(diào)果糖進(jìn)入糖酵解和磷酸戊糖通路的比例,促進(jìn)果糖轉(zhuǎn)化甘露糖和甘露聚糖,而作為細(xì)胞壁主要組分的甘露聚糖有利于硒的吸附和吸收[18]。此外,Fru組酵母中SAM1(EC:2.5.1.6)下調(diào),MET6(EC:2.1.1.14)上調(diào),有利于抑制L-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸,促進(jìn)上游同型半胱氨酸積累,并依次催化硒半胱氨酸轉(zhuǎn)化為硒胱硫醚、硒同型半胱氨酸,最后合成硒代蛋氨酸[19-20]；Fru組酵母中GLT1(EC:1.4.1.13、EC:1.4.1.14)表達(dá)下調(diào),GND1(EC:1.1.1.44)上調(diào),有助于抑制胞內(nèi)谷胱甘肽酶解為谷氨酸、甘氨酸和乙酰CoA,促進(jìn)谷胱甘肽在細(xì)胞內(nèi)積累；并維持谷胱甘肽的還原態(tài)[21-22],提高細(xì)胞的抗氧化能力(表3)。

表3 與果糖代謝和硒代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因

Table 3 DEGs involved in fructose and selenium metabolism in H.polymorpha

3 結(jié)論與討論

硒是維持人體正常生命活動(dòng)的必需元素,是人和動(dòng)物體內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性中心的必需基團(tuán),具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等多種生物功能。通過(guò)微生物富集硒元素的富硒酵母不僅活性硒含量高,而且富含谷胱甘肽、蛋白質(zhì)和維生素,是一種很好的硒補(bǔ)充劑[1-3,23]。

本文考察了多形漢遜酵母在含有不同濃度果糖和葡萄糖的富硒培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和Se-Met產(chǎn)量變化,發(fā)現(xiàn)與相同濃度葡萄糖發(fā)酵組相比,80 g/L果糖組酵母細(xì)胞產(chǎn)量略低,但其胞內(nèi)Se-Met含量較高,表明葡萄糖有利于多形漢遜酵母的生長(zhǎng),而果糖有利于硒的吸收和Se-Met等硒復(fù)合物的合成和積累[24]。MARINESCU等[25]用果葡糖漿[m(果糖)∶m(葡萄糖)=55∶45]作為碳源,并添加30～180 mg/L Na2SeO3進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)有機(jī)硒含量達(dá)到625.81～2 215.67 mg/g,提示可以通過(guò)優(yōu)化碳源中果糖與葡萄糖比例和含量,進(jìn)一步提高酵母有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率。

本研究采用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)對(duì)果糖發(fā)酵組與葡萄糖發(fā)酵組之間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析,篩選出221個(gè)DEGs,進(jìn)一步KEGG富集分析表明這些DEGs主要在糖酵解、果糖和甘露糖代謝、谷氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、硒復(fù)合物代謝和谷胱甘肽代謝、氧化還原通路中顯著富集。其中MPG1(EC:2.7.7.13)、同型MET6(EC:2.1.1.14)和GND1(EC:1.1.1.44)在果糖發(fā)酵組中顯著上調(diào),為催化合成細(xì)胞壁甘露聚糖,促進(jìn)硒的吸附和吸收[18],催化硒半胱氨酸轉(zhuǎn)化合成硒代蛋氨酸和維持為谷胱甘肽的還原態(tài)[21],提高細(xì)胞的抗氧化能力提供酶促動(dòng)力。

本研究部分解析了果糖對(duì)多形漢遜酵母菌硒代謝及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的影響,為進(jìn)一步優(yōu)化酵母富硒發(fā)酵工藝和分子育種提供一定的參考數(shù)據(jù)。