鑒定紅曲菌中萘醌響應(yīng)基因提高紅曲色素產(chǎn)率

紅曲色素是由紅曲菌(也稱紅曲霉)(Monascus spp.)合成的一類次級代謝產(chǎn)物[1-2],作為天然食用色素,在我國以及東南亞地區(qū)使用至今已有1 000多年歷史[3]。近年來,紅曲色素以其著色自然、健康無毒以及色調(diào)溫和等特點,成為國內(nèi)銷量較高的天然食用色素之一,并出口到歐美等發(fā)達國家[4]。

目前紅曲色素生產(chǎn)菌株的產(chǎn)率仍不能完全滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。因此,提高紅曲菌產(chǎn)率仍是本領(lǐng)域中的核心課題[5-6]。前期研究發(fā)現(xiàn),萘醌化合物能夠促進紅曲菌合成紅曲色素[7]，如果能夠找到紅曲菌中響應(yīng)萘醌化合物的基因,將有可能利用萘醌化合物提高紅曲色素產(chǎn)率。然而,目前紅曲菌的萘醌響應(yīng)基因仍未見報道[7]。

隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)與人工智能的發(fā)展,已有報道可以借助這2種工具來挖掘目標(biāo)基因[8-9]。人工智能是一種利用不同計算機算法來進行數(shù)據(jù)學(xué)習(xí),得到描述生物等過程模型的預(yù)測方法[10]。近年來發(fā)展起來的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network,ANN)模型,能夠較為精確地描繪微生物中基因與表型之間的內(nèi)在關(guān)系,用于挖掘參與特定生物過程的關(guān)鍵基因[8-10]。

本研究首先利用轉(zhuǎn)錄組方法初步篩選了M.ruber M7菌株中參與萘醌響應(yīng)的基因,然后選擇并優(yōu)化得到ANN模型,借此預(yù)測出2個可能性最高的萘醌響應(yīng)基因,利用基因敲除菌株驗證mga2基因是萘醌響應(yīng)基因,以期利用白花丹醌誘導(dǎo)mga2基因過表達菌株獲得較高的紅曲色素產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Monascus ruber M7(CCAM 070120,Culture Collection of State Key Laboratory of Agricultural Microbiology)為本實驗保存。紅曲菌基因敲除菌株ΔlaeA、ΔmrpigB和Δmga2,以及mga2基因過表達菌株M7::PtrpC-mga2為本課題組前期構(gòu)建并保存。萘醌類化合物1,4-萘醌、甲萘醌、1,2-萘醌、白花丹醌、5-羥基-1,4-萘醌與拉帕醇,上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型分光光度計,日本Shimadzu公司；LC-20AT高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 M.ruber M7的生物量測定

將M.ruber M7接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)斜面培養(yǎng)基上,在28 ℃條件下培養(yǎng)10 d,用無菌水洗滌斜面菌絲上的孢子,得到5×105 孢子/mL的孢子液。將5 mL孢子液接種到50 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基中,在28 ℃,120 r/min的條件下培養(yǎng)。發(fā)酵第12天時,離心(5 000 r/min)分離菌絲體和發(fā)酵液,冷凍干燥后稱量菌絲體干質(zhì)量。

1.3.2 萘醌化合物誘導(dǎo)發(fā)酵實驗

將萘醌化合物預(yù)先溶解于二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)。在液態(tài)發(fā)酵第5天時,將萘醌溶液加入發(fā)酵液中,繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 紅曲色素的測定

取冷凍干燥的菌絲體0.1 g,研磨成細粉后加入5 mL甲醇溶液(體積分數(shù)為80%),于60 ℃條件下提取胞內(nèi)紅曲色素1 h,12 000 r/min離心5 min,棄去沉淀收集上清液。上清液用甲醇溶液(體積分數(shù)為80%)稀釋到適當(dāng)倍數(shù),分別測定上清液在380、470、520 nm處的吸光度值,分別計算菌絲體中黃、橙、紅色素的色價,總色價為三者之和[11]。色價計算如公式(1)所示：

色價=A×總稀釋倍數(shù)

(1)

式中：A為特定波長的吸光度值。

1.3.4 紅曲菌總RNA的提取和轉(zhuǎn)錄組測序

選取受萘醌化合物誘導(dǎo)的M.ruber M7為樣本,以未誘導(dǎo)的M.ruber M7為空白對照。采用Trizol法提取M.ruber M7的總RNA,檢測RNA的OD260/OD280在1.8～2.2,確保總RNA質(zhì)量,然后利用Agilent 2100生物分析儀驗證RNA樣品的完整性。由微浪生物科技有限公司進行cDNA文庫的構(gòu)建及高通量測序,得到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

基因mga2的相對轉(zhuǎn)錄水平按前期所建立的實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRTPCR)方法測定[7]。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組分析與萘醌響應(yīng)基因預(yù)測

首先根據(jù)reads長度、paired-end關(guān)系、質(zhì)量值等,采用FPKM法估算基因表達水平,然后對read count進行標(biāo)準(zhǔn)化,再進行假設(shè)檢驗概率計算,最后進行多重假設(shè)檢驗校正。對不同萘醌類化合物處理的紅曲菌樣品,分析各樣品中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),當(dāng)同一個基因的表達量在不同樣品間顯示出差異時,如果其假陽性率<0.05,且差異倍數(shù)>3,則認為該基因在不同樣品中具有顯著差異表達。

1.3.6 人工智能預(yù)測萘醌響應(yīng)基因

將萘醌響應(yīng)基因及其對應(yīng)樣本的紅曲色素產(chǎn)量信息,分別定義為輸入變量。采用Auto-sklearn軟件[12],建立線性模型(linear models)、偏最小二乘回歸(partial least squares regression model,PLSR)、彈性網(wǎng)絡(luò)模型(elastic net model)、隨機森林模型(random forest model)、ANN模型這5種預(yù)測模型[13]。

為了提高ANN的預(yù)測精度并降低計算量,通過篩選激活函數(shù)和優(yōu)化器對ANN進行優(yōu)化,并計算和校驗ANN的預(yù)測準(zhǔn)確率[14]。利用優(yōu)化后的ANN預(yù)測得到萘醌響應(yīng)基因,如果這些基因的貢獻率>95%,則認為這些基因即為萘醌響應(yīng)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 萘醌化合物提高紅曲色素產(chǎn)率

選擇6種萘醌化合物,以不同濃度(10、30或50 μmol/L)分別添加到培養(yǎng)5 d的M.ruber M7培養(yǎng)物中。1,4-萘醌、甲萘醌、白花丹醌和拉帕醇這4種萘醌能夠顯著提高紅曲色素產(chǎn)率。其中,30 μmol/L的白花丹醌效果最明顯,紅曲色素產(chǎn)率從1 131 U/mg增加到1 436 U/mg(圖1)。HU等[15]也發(fā)現(xiàn)萘醌化合物在低濃度下能促進M.ruber M7合成紅曲色素。結(jié)果證明萘醌化合物能夠促進紅曲色素合成,也說明紅曲菌中可能存在萘醌響應(yīng)基因。

a-10 μmol/L萘醌化合物；b-30 μmol/L萘醌化合物；c-50 μmol/L萘醌化合物

圖1 添加外源萘醌化合物提高M.ruber M7的紅曲色素產(chǎn)率

Fig.1 Improvement of Monascus pigments yield by exogenous naphthoquinone

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與人工智能模型聯(lián)用預(yù)測萘醌響應(yīng)基因

分別測定了1,4-萘醌、甲萘醌、白花丹醌和拉帕醇在不同濃度條件(10、30或50 μmol/L)處理M.ruber M7的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和紅曲色素產(chǎn)率數(shù)據(jù)。采用PLS-DA對基因轉(zhuǎn)錄表達數(shù)據(jù)進行分析,共得到20個差異基因(表1)。其中,17個基因涉及細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑,其余3個基因分別涉及萘醌降解途徑[16]、麥角固醇合成途徑[17]以及紅曲色素合成途徑[18]。

表1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法預(yù)測的萘醌響應(yīng)基因

Table 1 Naphthoquinone-responsive genes predicted by transcriptomics analysis

注：“↑”代表基因表達水平提高3倍以上;“↓”代表基因表達水平降低1/3以上。樣品:a,14 NQ;b,menadione;c,plumbagin;d,lapachol

為了縮小萘醌響應(yīng)基因的范圍,利用紅曲色素產(chǎn)率和差異表達基因的數(shù)據(jù),分別對Linear、PLSR、Elastic Net、Random forest和ANN這5種人工智能模型進行了訓(xùn)練。平均交叉驗證系數(shù)(R2)通常被認為是判斷模型的預(yù)測值和實測值之間相關(guān)性的重要指標(biāo),而擬合標(biāo)準(zhǔn)差(root mean square error,RMSE)是反映模型預(yù)測值與實際測量值之間平均差距的關(guān)鍵參數(shù)。比較5種模型,發(fā)現(xiàn)ANN的R2最高,而RMSE最低(圖2-a和圖2-b),說明ANN能夠更好地預(yù)測M.ruber M7的萘醌響應(yīng)過程。目前人工智能模型中,ANN也被認為是預(yù)測生物體內(nèi)復(fù)雜過程的重要工具[19]。

盡管ANN在這些模型中較優(yōu),但該ANN模型的預(yù)測精度僅有0.72。為進一步優(yōu)化該模型(圖2-d),采用激活函數(shù)來提高預(yù)測精度和降低計算量[20]。本研究嘗試了3種激活函數(shù),其中LReLu表現(xiàn)最好,使ANN預(yù)測精度提高到0.81(圖2-d)。但此時ANN仍需要較高的訓(xùn)練步數(shù)(>25 000步)。進一步采用優(yōu)化器Adam降低轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的噪聲以提高擬合水平[21],結(jié)果表明訓(xùn)練步數(shù)僅需要6 000步就能夠?qū)⒕忍岣咧?.87(圖2-e)。

a-不同模型的平均交叉驗證系數(shù)R2；b-不同模型的擬合標(biāo)準(zhǔn)差RMSE；c-ANN模型計算過程示意圖；d-激活函數(shù)對ANN模型預(yù)測精度的影響；e-優(yōu)化器對ANN模型預(yù)測精度與計算步數(shù)的影響

圖2 人工智能模型的篩選以及ANN模型的優(yōu)化

Fig.2 Selection and optimization of ANN model

利用優(yōu)化后的ANN模型進一步從20個基因中預(yù)測出4個萘醌響應(yīng)基因：laeA、mga2、artR和sk。laeA和mga2在4種萘醌類化合物條件下都被ANN模型預(yù)測為萘醌響應(yīng)基因。而artR和sk這2個基因卻僅在一定條件下被作為萘醌響應(yīng)基因(表2)?；騛rtR在絲狀真菌中調(diào)控麥角固醇的生物合成[22]。基因sk是鞘磷脂生物合成途徑中的關(guān)鍵基因,可能涉及細胞生長和發(fā)育[23]。因此artR和sk也可能參與了M.ruber M7的萘醌響應(yīng)過程,但需要一定的條件才能有明顯表現(xiàn)。因此,最終選擇laeA和mga2作為進一步研究對象。

表2 優(yōu)化ANN模型預(yù)測的萘醌響應(yīng)基因

Table 2 Naphthoquinone-responsive genes revealed by the optimized ANN model

2.3 萘醌添加發(fā)酵實驗驗證mga2基因是萘醌響應(yīng)基因

為了驗證laeA和mga2這2個基因中哪個是萘醌響應(yīng)基因,我們利用相應(yīng)的基因敲除菌株進行萘醌添加發(fā)酵實驗。萘醌誘導(dǎo)條件下Δmga2菌株的萘醌響應(yīng)顯著減弱,紅曲色素產(chǎn)率的誘導(dǎo)效果消失(圖3-a～圖3-c),說明缺乏mga2基因后紅曲菌株無法響應(yīng)萘醌化合物。ΔlaeA菌株在萘醌化合物誘導(dǎo)條件下,依然保留了一定的誘導(dǎo)效果(圖3-d～圖3-f),說明laeA不是主要的響應(yīng)基因。基因mga2是G蛋白中的β亞基,參與G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,因此萘醌化合物可能激活質(zhì)異三聚體G蛋白,mga2亞基則向下游傳導(dǎo)信號,促進紅曲色素合成過程[24]。

a-10 μmol/L萘醌誘導(dǎo)Δmga2菌株；b-30 μmol/L萘醌誘導(dǎo)Δmga2菌株；c-50 μmol/L萘醌誘導(dǎo)Δmga2菌株；d-10 μmol/L萘醌誘導(dǎo)ΔleaA菌株；e-30 μmol/L萘醌誘導(dǎo)ΔleaA菌株；f-50 μmol/L萘醌誘導(dǎo)ΔleaA菌株

圖3 萘醌添加實驗驗證mga2基因是萘醌響應(yīng)基因

Fig.3 Identification of mga2 as the naphthoquinone-responsive gene by naphthoquinone feeding assay

2.4 萘醌誘導(dǎo)mga2基因過表達菌株提高紅曲色素產(chǎn)率

研究進一步利用mga2的過表達菌株M7::PtrpC-mga2實現(xiàn)萘醌介導(dǎo)的紅曲色素產(chǎn)率提高。該過表達菌株為實驗室前期構(gòu)建,其紅曲色素產(chǎn)率為1 126 U/mg,與原始菌株M7沒有顯著差異。首先測定了不同種類萘醌化合物在30 μmol/L濃度下對菌株紅曲色素產(chǎn)率的影響,發(fā)現(xiàn)白花丹醌條件下紅曲色素產(chǎn)率最高,比對照組提高了52%,達到1 719 U/mg(圖4-a)。然后測定了不同濃度(0、10、20、30、40 μmol/L)白花丹醌的影響,結(jié)果表明,在20 μmol/L濃度下,過表達菌株的紅曲色素產(chǎn)率達到1 877 U/mg(圖4-b)。研究還測定了白花丹醌的添加時機,發(fā)現(xiàn)在菌株培養(yǎng)第3天加入20 μmol/L的白花丹醌,紅曲色素產(chǎn)率進一步提高到了2 002 U/mg(圖4-c)。同時,我們還測定了野生菌株M7和過表達菌株M7::PtrpC-mga2中mga2基因的轉(zhuǎn)錄表水平,發(fā)現(xiàn)過表達菌株中該基因的轉(zhuǎn)錄水平是野生菌株的4.2倍(圖4-d)。綜合以上結(jié)果說明提高mga2基因的表達量能夠增強紅曲菌對萘醌的響應(yīng)能力。最后,研究還測定了紅曲色素發(fā)酵的過程曲線,可見白花丹醌誘導(dǎo)后紅曲色素產(chǎn)率顯著增加(圖4-e)。

a-不同萘醌對菌株M7::PtrpC-mga2紅曲色素產(chǎn)率的影響；b-不同濃度白花丹醌對菌株M7::PtrpC-mga2紅曲色素產(chǎn)率的影響；c-不同誘導(dǎo)時機對菌株M7::PtrpC-mga2紅曲色素產(chǎn)率的影響；d-原始菌株與M7::PtrpC-mga2菌株中mga2基因的相對表達水平；e-原始菌株與M7::PtrpC-mga2菌株發(fā)酵紅曲色素的過程曲線

圖4 白花丹醌誘導(dǎo)提高M7::PtrpC-mga2菌株的紅曲色素產(chǎn)率

Fig.4 Improvement of Monascus pigments yield in strain M7::PtrpC-mga2 by plumbagin induction

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)萘醌化合物能夠提高紅曲色素產(chǎn)率,然后通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和人工智能模型聯(lián)用的方法預(yù)測到可能的萘醌響應(yīng)基因,利用基因工程菌株驗證后,成功用于提高紅曲色素產(chǎn)率。研究發(fā)現(xiàn),G蛋白中的β亞基mga2是紅曲菌中的萘醌響應(yīng)基因,利用該基因的過表達菌株,在白花丹醌誘導(dǎo)下紅曲色素產(chǎn)率顯著提高。本研究不僅率先發(fā)現(xiàn)紅曲菌中的萘醌響應(yīng)基因,并應(yīng)用于提高紅曲色素產(chǎn)率,也為其他真菌中相似研究提供了方法上的借鑒。