低產(chǎn)高級醇工業(yè)上面發(fā)酵酵母的選育

啤酒是以酒花和麥芽汁為原料,由啤酒酵母釀制而成的酒精飲料[1]。酵母代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)決定了啤酒的感官特性。根據(jù)風(fēng)味物質(zhì)的化學(xué)屬性,可將其分為醇類、醛類、酸類、酯類、酮類、內(nèi)酯類化合物、縮醛類化合物、吡嗪類化合物、呋喃類化合物、芳香族化合物、硫化物等[2-3]。其中,高級醇是指3個或3個以上碳原子的醇類的統(tǒng)稱,同時也稱為雜醇油[1],是啤酒中重要的風(fēng)味物質(zhì),主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、苯乙醇[4-5]。

啤酒中高級醇的含量一般為70～100 mg/L,而優(yōu)質(zhì)啤酒對高級醇含量的控制更為嚴(yán)格,通常在50～90 mg/L [6]。適量的高級醇能賦予啤酒獨特的香味,含量過低,酒體不豐滿,口感較差;但含量過高時,不僅會影響酒體的協(xié)調(diào)性,還會對飲用者的身體產(chǎn)生明顯的副作用[7-9]。啤酒高級醇含量過高是業(yè)內(nèi)普遍存在的問題,如何將高級醇含量控制在合理范圍對于提升啤酒品質(zhì)具有重要的意義。目前,高級醇的調(diào)控主要有兩種手段：一是通過原輔料、發(fā)酵溫度、溶氧量等指標(biāo)調(diào)控來優(yōu)化發(fā)酵工藝；二是從發(fā)酵菌種出發(fā),通過選育低產(chǎn)高級醇的優(yōu)良酵母菌株從根本上降低高級醇含量。

近年來,隨著對誘變技術(shù)的深入研究,由清華大學(xué)邢新會研究團隊自主研發(fā)的常壓和室溫等離子(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變技術(shù)已經(jīng)成為了一種新型的育種方法。與傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相比,此項技術(shù)具有操作簡便、安全性高、高通量誘變、高總突變率和正向突變率高的特點[10],已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細菌、真菌、微藻等多種微生物的改造[11-15]。

篩選過程是選育低產(chǎn)高級醇酵母菌株的關(guān)鍵限速步驟。傳統(tǒng)的搖瓶發(fā)酵篩選方法雖然準(zhǔn)確度較高,但操作繁瑣、周期長、工作量大,無法做到菌株的快速篩選[16]。近年來,高通量篩選得到了快速發(fā)展。研究表明,分光光度法可以實現(xiàn)高級醇含量的快速檢測[17]。此外,微孔板的高通量篩選技術(shù)在菌株篩選方面也取得了良好的效果,提高了篩選效率[18-19]。這些均為低產(chǎn)高級醇酵母菌株的高通量篩選提供了新的策略。

本研究以工業(yè)酵母(Saccharomyces cerevisiae)680bg為出發(fā)菌株,利用ARTP誘變技術(shù)對其菌懸液進行處理,運用微孔板培養(yǎng)法結(jié)合分光光度法,建立高通量篩選方法,以期篩選低產(chǎn)高級醇菌株,為啤酒酵母的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

Saccharomyces cerevisiae 680bg,德國專用小麥啤酒上面酵母,由某啤酒公司提供。

1.1.2 主要試劑

酵母浸粉,北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨,天津市英博生化試劑有限公司；葡萄糖,分析純,天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；瓊脂粉、瓊脂糖,Solarbio公司；NaCl、亞鐵氰化鉀,均為分析純,天津市北方化玻購銷中心；H2SO4,天津市化學(xué)試劑一廠；dNTP,TaKaRa公司；PEG3350,分析純,北京索萊寶科技有限公司；酒石酸鉀鈉,分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；正丙醇標(biāo)準(zhǔn)品、異丁醇標(biāo)準(zhǔn)品、2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品,均為色譜純,天津聯(lián)星化工有限公司；CuSO4,天津市化學(xué)試劑六廠；對二甲氨基苯甲醛,分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 主要儀器

T gL-16C臺式離心機,上海安亭科技儀器廠；UVmini-1240紫外分光光度計,島津儀器(蘇州)有限公司；gL20A型高速冷凍離心機,中科院生物物理所技術(shù)服務(wù)公司；ARTP-II型ARTP等離子體誘變儀,北京思清源生物科技有限公司；全自動生長曲線分析儀,芬蘭BIOSCREEN公司；7890A氣相色譜儀,美國安捷倫科技公司。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

(1)YEPD培養(yǎng)基:2%葡萄糖,2%蛋白胨,1%酵母浸粉,pH自然,115 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需在此基礎(chǔ)上再添加2%瓊脂粉。

(2)LB培養(yǎng)基:1%蛋白胨,1%NaCl,0.5%酵母浸粉,pH自然,115 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需在此基礎(chǔ)上再添加2%瓊脂粉。

(3)麥芽汁培養(yǎng)基:由某啤酒公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 680bg菌株生長曲線的繪制

從斜面上挑取菌種1環(huán)接種到裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中,30 ℃條件下靜置培養(yǎng)過夜。按2%～5%接種量接種,在培養(yǎng)溫度為30 ℃,600 nm下用全自動生長曲線分析儀測定菌株的吸光值,期間每隔1 h測定菌液的OD600值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),OD600值為縱坐標(biāo),繪制菌株的生長曲線。

1.2.2 啤酒發(fā)酵工藝

取斜面菌種1環(huán)接種于盛有50 mL麥芽汁培養(yǎng)基(麥汁濃度為12 °P)的三角瓶中(250 mL),25 ℃培養(yǎng)36 h。將種子液在6 500 r/min的條件下離心3 min,棄上清液,以25 mL的無菌水洗滌2次。按照100 g/L的接種量接種于裝有150 mL麥汁(麥汁濃度為12 oP)的250 mL三角瓶中,16 ℃靜置發(fā)酵7 d。

1.2.3 ARTP誘變條件的確定

取培養(yǎng)至對數(shù)中期的菌液離心,棄上清液,用無菌生理鹽水將其稀釋成OD600值在0.6～0.8的菌懸液。準(zhǔn)確吸取10 μL菌液均勻的涂于無菌金屬載片表面后立即進行ARTP誘變處理。調(diào)節(jié)各項參數(shù),使載片與放射源之間距離為2.5 mm、儀器功率為100 W、氣流量參數(shù)為10 SLM。分別從0、10、20、25、30、35、40、45 min開始處理樣品。誘變后,將載片轉(zhuǎn)移至裝有1 mL生理鹽水的1.5 mL的EP管中,振蕩2 min。取適量菌懸液涂布于初篩平板上,30 ℃倒置培養(yǎng)48 h。觀察菌株生長情況,計算菌落數(shù)與致死率。最后以誘變時間為橫坐標(biāo)、誘變時間對應(yīng)的致死率為縱坐標(biāo)繪制致死曲線。

1.2.4 高通量篩選方法的建立

為了從大批誘變菌株中快速高效地篩選出低產(chǎn)高級醇工業(yè)酵母菌株,建立了分光光度法結(jié)合48孔板發(fā)酵的高通量篩選方法。將誘變處理后的菌懸液稀釋涂布于YEPD固體平板上,30 ℃培養(yǎng)36 h。挑選單菌落于新的YEPD平板上,30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用干凈的槍頭將誘變菌株挑入裝有1 mL麥汁的48孔板中,16 ℃連續(xù)發(fā)酵適當(dāng)時間后離心取上清液稀釋。在比色管中加入1.2 mL稀釋后的上清液,置于冰水浴中,沿管壁緩慢的加入0.8 mL 0.5%的對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液,輕輕晃動各管使反應(yīng)液混勻,沸水浴15 min,冷卻備用。將反應(yīng)液加到96孔透明酶標(biāo)板中,在520 nm下測其吸光度。

1.2.5 突變株的復(fù)篩驗證

運用高通量篩選方法雖然可以快速地篩選出高級醇含量降低的菌株,但是準(zhǔn)確性較差,為了提高實驗的精確度,還需將初篩菌株搖瓶發(fā)酵后利用氣相色譜技術(shù)進行復(fù)篩驗證。將初篩菌株與出發(fā)菌株680bg按小麥啤酒發(fā)酵工藝條件進行250 mL體系的三角瓶發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后檢測發(fā)酵液的高級醇含量、酒精度、發(fā)酵度等重要指標(biāo)。選擇高級醇含量顯著降低,其他生理指標(biāo)不變的菌株繼續(xù)發(fā)酵3輪,最后將高級醇含量降低、各項生理指標(biāo)不變且遺傳性能穩(wěn)定的菌株定為篩選出來的優(yōu)良菌株。

1.2.6 發(fā)酵性能分析

通過CO2排放量的測定來監(jiān)測整個發(fā)酵過程,每隔12 h稱重1次,當(dāng)12 h失重≤0.1 g時,表明發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束。測定發(fā)酵液殘?zhí)呛?、酒精度以及真正發(fā)酵度。發(fā)酵液蒸餾后采用氣相色譜儀檢測高級醇含量。

檢測條件：FID檢測器,毛細管色譜柱HP-INNOWAX(50 m×320 μm×1.0 μm)載氣為純度為99.99%的高純氮氣,分流比1∶10。進樣口溫度200 ℃,檢測器溫度200 ℃,進樣量1 μL。采用程序升溫,50 ℃保持8 min,5 ℃/min升溫,升溫至180 ℃,保持15 min,每個樣品處理時間43 min,為保持?jǐn)?shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,每個樣品進樣2次,取平均值。

1.2.7 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性能分析

將活化的誘變菌株于種子培養(yǎng)基中進行連續(xù)8次傳代培養(yǎng),再通過搖瓶發(fā)酵檢驗每代突變菌株產(chǎn)高級醇能力及各項基本性能的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 680bg菌株生長曲線的繪制

一般選擇處于對數(shù)中期的菌株進行ARTP離子誘變,為了確定菌株680bg對數(shù)中期,依照方法1.2.1測定并繪制了680bg的生長曲線。結(jié)果如圖1所示,酵母菌株680bg在培養(yǎng)5.5 h時處于對數(shù)中期,所以選取培養(yǎng)5.5 h的酵母細胞進行誘變處理。

圖1 出發(fā)菌株680bg的生長曲線

Fig.1 The growth curve of original strain 680bg

2.2 ARTP誘變致死曲線的繪制

據(jù)報道,誘變的致死率約為80%～85%時,誘變效果較好。因此,依據(jù)方法1.2.3,對出發(fā)菌株680bg進行誘變處理,并繪制致死率曲線,結(jié)果如圖2所示。出發(fā)菌株680bg的致死率隨照射時間的延長而逐步增大,當(dāng)誘變時間為35 s時酵母菌株的致死率為81%,誘變50 s時菌株已經(jīng)全部死亡。因此,選取35 s作為后續(xù)處理的誘變時間。

圖2 出發(fā)菌株680bg的致死率曲線

Fig.2 The lethal rate curve of original strain 680bg

2.3 誘變菌株的初篩

目前高級醇的檢測方法主要包括比色法和氣相色譜法[20],其中氣相色譜法可以準(zhǔn)確地測量出高級醇含量,但是操作起來較為繁瑣,耗時耗力,不適合初篩工作。比色法操作簡單方便,雖不能準(zhǔn)確測量出高級醇具體數(shù)值,但卻能粗略地評價高級醇(主要是異丁醇與異戊醇)含量。前期研究表明,出發(fā)菌株680bg代謝生成的高級醇主要是異丁醇和異戊醇。因此,本研究利用比色法對菌株進行初篩選,而后利用氣相色譜法對菌株進行復(fù)篩驗證。

2.3.1 誘變菌株初篩方法的建立

高級醇經(jīng)濃硫酸脫水后轉(zhuǎn)化的不飽和烴可與對二甲氨基苯甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)生成橙黃色化合物,該產(chǎn)物在520 nm處有最大吸收值,且含量與吸收值符合朗伯-比爾定律[17]。為了確定發(fā)酵液中的高級醇含量與其在520 nm處吸光值相關(guān)性,以發(fā)酵液中高級醇濃度為橫坐標(biāo),520 nm處吸光值為縱坐標(biāo)繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線,并且得出吸光值與高級醇之間關(guān)系式為y=0.002 6x-0.007 6。由此可知,發(fā)酵液中的高級醇濃度與其在波長520 nm處吸光值之間存在正相關(guān)性。然而,該標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2僅為0.986 65,不能準(zhǔn)確反應(yīng)高級醇的含量。因此,該方法只適用于菌株的初步篩選。

2.3.2 誘變菌株培養(yǎng)時間的確定

為了測定誘變菌株在48孔板中的最優(yōu)培養(yǎng)時間,將出發(fā)菌株分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84 h后,按1.2.4介紹的方法測量其在各個時間點產(chǎn)生高級醇所對應(yīng)的OD520值。由圖3可知,在培養(yǎng)12～48 h期間,菌株代謝產(chǎn)生的高級醇含量急劇增加,在培養(yǎng)60 h后高級醇生成速率變慢,直到72 h時,高級醇含量趨于穩(wěn)定,不再增加。因此,選取72 h作為后續(xù)實驗的培養(yǎng)時間。

圖3 出發(fā)菌株680bg在不同培養(yǎng)時間下高級醇的生成量(OD520)

Fig.3 The higher alcohols production(OD520)of original strain 680bg at different cultivation times

2.3.3 誘變菌株初篩結(jié)果

將出發(fā)菌株與誘變菌株培養(yǎng)72 h后,依照方法1.2.4所描述的內(nèi)容對其進行比色法處理,以誘變菌株為橫坐標(biāo),其所對應(yīng)的OD520值與出發(fā)菌株OD520值的比值為縱坐標(biāo)繪制了如圖4所示的柱狀圖,將比值在0.4～0.65的菌株初步認定為低產(chǎn)高級醇的菌株,共篩選得到51株誘變菌株。

a-初篩菌株；b-初篩菌株

圖4 低產(chǎn)高級醇菌株的初篩

Fig.4 Preliminary screening for strains with lower yield of high alcohol

2.4 誘變菌株復(fù)篩

由于比色法只能粗略地檢測高級醇的含量,且此法受溫度等因素的影響較大,難免會產(chǎn)生一定的偏差,為了更加精確地篩選出低產(chǎn)高級醇菌株,需要對51株初篩菌株與出發(fā)菌株680bg進行發(fā)酵驗證。

2.4.1 高級醇含量比較

采用1.2.2介紹的發(fā)酵工藝培養(yǎng)菌株7 d,取發(fā)酵液離心、蒸餾,用氣相色譜技術(shù)檢測誘變菌株與出發(fā)菌株高級醇含量。結(jié)果如表1所示,經(jīng)過誘變、反復(fù)篩選,共得到了8株低產(chǎn)高級醇菌株,其中,ARTP-162菌株產(chǎn)生的高級醇含量是所有菌株中最低的,與出發(fā)菌株相比降低了約21%,其他的誘變菌株(ARTP-5、ARTP-12、ARTP-32、ARTP-65、ARTP-109、ARTP-113、ARTP-129)的高級醇含量也較出發(fā)菌株分別降低了14.3%、12%、11.25%、9.9%、12.1%、12.8%、11.1%。

表1 誘變菌株與出發(fā)菌株高級醇含量 單位：mg/L

Table 1 Comparison of higher alcohol contents between mutated strain and the original strain

2.4.2 基本理化指標(biāo)比較

待發(fā)酵結(jié)束后,對所有菌株的酒精度、真正發(fā)酵度及發(fā)酵力等理化指標(biāo)進行測定、分析。如表2所示,與出發(fā)菌株680bg相比,誘變菌株無論是在CO2釋放量、酒精度還是真正發(fā)酵度上,均沒有發(fā)生明顯的變化。這意味著這些誘變菌株不僅具有低產(chǎn)高級醇的特性還保留了良好的發(fā)酵性能。

表2 出發(fā)菌株680bg及誘變菌株的基本發(fā)酵性能

Table 2 Fermentation performances of original strain 680bg and mutated strain

2.5 誘變菌株遺產(chǎn)穩(wěn)定性檢測

通過連續(xù)傳代實驗,對菌株ARTP-162的遺傳穩(wěn)定性進行了分析。如圖5所示,隨著傳代次數(shù)的增加,誘變菌株ARTP-162的產(chǎn)高級醇能力、酒精度、真正發(fā)酵度及CO2生成量等基本發(fā)酵性能并沒有發(fā)生大變化,直至第八代也基本維持穩(wěn)定,這表明誘變菌株ARTP-162遺傳性能穩(wěn)定,可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

a-傳代次數(shù)對菌株高級醇產(chǎn)量的影響；b-傳代次數(shù)對菌株酒度、發(fā)酵度及總失重的影響

圖5 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

Fig.5 Analysis of genetic stability of mutagenic strain

3 結(jié)論

ARTP離子誘變是一種新型有效的誘變育種方法。本研究以菌株680bg為出發(fā)菌株,運用ARTP離子誘變手段對其進行誘變處理,經(jīng)48孔板培養(yǎng)后用高級醇分光光度法快速檢測菌株的高級醇含量,建立了完整有效的高通量篩選方法。經(jīng)過兩輪篩選,共得到了8株低產(chǎn)高級醇誘變菌株,其中誘變菌株ARTP-162降低效果最為顯著,大約降低了21%,且遺傳性能穩(wěn)定。該方法的建立為低產(chǎn)高級醇菌株的選育提供了新的策略。