蓮中原花青素的研究進展

蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)也被稱為中國睡蓮、圣蓮或印度蓮，是一種睡蓮科(Nelumbonaceae)蓮屬(Nelumbo Adans)多年生水生草本植物(圖1)，根據(jù)形態(tài)和利用部位，分為子蓮、花蓮和藕蓮3種類型。我國是蓮的主要起源地之一，蓮種植歷史悠久，種質資源豐富。近年來，我國蓮產(chǎn)業(yè)規(guī)模穩(wěn)步發(fā)展，種植區(qū)域面積逐步增大，其中藕蓮、子蓮種植面積分別達到4.0×105、1.0×105 hm2 [1-2]。蓮的各個部位可食用或藥用，其根狀莖即蓮藕或藕帶可作蔬菜食用，鮮蓮子可作水果食用，花可供觀賞或藥食，蓮葉、蓮房、蓮子、蓮心、蓮須與藕節(jié)等皆可入藥，由于富含生物堿類、黃酮類等活性物質成分[3]，賦予其多種藥理活性，如良好的預防心血管疾病、抗氧化、抗炎癥、抗癌、抗菌、抗病毒、降血糖、調脂減肥等作用[4]，其中原花青素是一類天然多酚黃酮類化合物，以其強大的抗氧化性能而聞名，已被證實是蓮發(fā)揮藥理作用的重要活性物質之一[5]。近年來國內外眾多學者對蓮中原花青素開展了研究工作，主要集中在其提取分離、抗氧化活性、藥理作用等方面[6-8]，但相關研究還不充分，尚無針對蓮中原花青素的檢測標準體系，其產(chǎn)品開發(fā)利用仍較少，提取分離工藝、毒理學等方面的研究有待深入。本文對蓮中原花青素的組分構成、提取分離、檢測分析及在食品中的應用等方面研究進行綜述，以期為后續(xù)深入研究蓮中原花青素及其開發(fā)利用提供參考。

圖1 蓮全株示意圖[9]
Fig.1 Schematic diagram of the whole lotus plant

1 蓮中原花青素的組分構成

原花青素(proanthocyanidins, PCs)又稱縮合單寧，是一類由黃烷-3-醇結構單元通過C—C鍵縮合形成的不同聚合度的混合物[10]，因在熱酸性溶液中可轉化成花青素而得名，是廣泛存在于植物中的天然多酚化合物，在葡萄籽(232.1 mg/g)[11]、花生衣(144.1～170.3 mg/g)[12]等植物組織中含量較高。按照黃烷-3-醇之間連接方式的不同，分為A型和B型，前者由1個碳鍵C4→C8或C4→C6和1個醚鍵C2→O→C7連接形成，后者通過1個碳鍵C4→C8或C4→C6連接形成，其中A型結構更細長、更堅固，性質更穩(wěn)定[13]；按照其聚合度的不同，分為低聚體(聚合度≤4)和高聚體(聚合度>4)，其中低聚體抗氧化活性更強，生物利用度更高[14]。

以往研究表明，不同品種及產(chǎn)地蓮中PCs含量存在差異[15-16]，蓮不同部位中PCs含量也不相同，從高到低依次為：蓮房>藕節(jié)>蓮葉>荷梗，以蓮房中含量最高(7.8%, 干重)[16]，且眾多研究顯示，蓮中PCs以B型為主，構成單元包括(+)-兒茶素(catechin, C)、(-)-表兒茶素(epicatechin, EC)、(+)-沒食子兒茶素(gallocatechin, GC)和(-)-表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)(圖2)，并且主要由單體、二聚體及三聚體組成，其中二聚體含量最高(占比為43.5%)，其次為三聚體(占比為37.4%)和單體(占比為3.25%)[17-20]。目前蓮中已知的PCs的類型如表1所示。

表1 蓮中的原花青素類型[5, 17-25]
Table 1 Proanthocyanidins isolated from lotus

注：A1,原花青素A1;A2,原花青素A2;B1,原花青素B1;B2,原花青素B2;B3,原花青素B3;B4,原花青素B4;ECG, 表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate)(下同)

圖2 蓮原花青素中黃烷-3-醇主要結構單元
Fig.2 Structures of the flavan-3-ol units in proanthocyanidins from lotus

2 蓮中原花青素的提取分離

2.1 樣品預處理

樣品預處理是蓮中PCs提取分離的重要環(huán)節(jié)之一，適當?shù)念A處理方式是保證PCs提取效率的重要前提。樣品的粒度和水分含量是影響植物樣品中PCs提取效率的2個重要因素。理論上，樣品越細與溶劑接觸面積越大，提取效率越高，但樣品過細大量細胞破裂，造成不溶性雜質溶出，給后續(xù)分離提純帶來困難。樣品中水分含量的增加會引起多酚氧化酶等一些酶促反應，從而降低樣品的穩(wěn)定性[10]。然而，干燥過程中失水會導致細胞收縮，從而降低細胞中PCs的提取效率。由于PCs是熱不穩(wěn)定型色素，對溫度、光及pH敏感[26]，為防止其氧化和降解，應存放在避光、低溫及弱酸性條件下。根據(jù)現(xiàn)有的研究報道，新鮮的蓮樣(蓮房、蓮葉、蓮藕等)采集回來后，用水洗凈[24-25,27]，然后在-20 ℃冷凍保存[24]，或熱風干燥(≤50 ℃)至恒重(含水量<10%)[16,22-23,25,27]，粉碎，過40～100目篩[5,22-23,25,27-28]，置于干燥器內，在-20 ℃保存?zhèn)溆谩２煌母稍锓椒▽ι徶蠵Cs提取得率具有顯著的影響。以蓮房為例，采用不同干燥方法獲得的PCs含量由高到低順序為：50 ℃恒溫烘干>通風避光處陰干>日光下直接曬干[15]，而采用-20 ℃ 冷凍48 h后自然風干的干燥方法比直接曬干的方法，PCs提取得率提高了47.6%[20]。

2.2 提取方法

PCs分子中含有多個酚羥基官能團，屬強極性物質，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性溶劑，由于在不同溶劑中溶解度有差異，可采用適當濃度(50%～75%,體積分數(shù))的有機溶液進行提取。LI等[5]采用丙酮溶液提取蓮子皮中PCs，按照料液比1∶54(g∶mL)，丙酮體積分數(shù)為67%、pH為2.7，溫度37 ℃，時間90 min的條件進行提取，再用乙酸乙酯提取3～4次，經(jīng)分離后得到蓮子皮原花青素純化物。表2列舉了近年來有關蓮中PCs主要的提取方法，包括有機溶劑提取法[17-21,25,27]、酶輔助提取法[28-30]、超聲輔助提取法[31-32]、微波輔助提取法[33]和脈沖超聲輔助提取法[34]，以及各提取方法的原理、應用實例和優(yōu)缺點。其中以乙醇溶液為提取劑的溶劑提取法使用最普遍，輔以酶、微波和超聲波等手段協(xié)同使用，有效利用各提取方法的優(yōu)勢，能夠快速并有效地提高蓮中PCs的提取效率和得率，并且操作簡單易行，被廣泛應用于蓮中PCs的提取，不同提取手段的協(xié)同使用以達到優(yōu)異的提取效果將是今后蓮中PCs提取的發(fā)展方向。

表2 蓮中原花青素的提取工藝方法
Table 2 The extraction methods of proanthocyanidins in lotus

2.3 分離純化方法

從蓮的不同部位提取的PCs粗提物中往往含有脂類、葉綠素、鞣質及其他酚類化合物等雜質成分，需進一步分離純化得到較高純度的產(chǎn)品，才能用于結構鑒定、功能研究、產(chǎn)品開發(fā)等方面。目前蓮中PCs粗提物的分離與純化沿襲了傳統(tǒng)的分離純化方法，主要包括溶劑萃取法[5,20-21]、大孔樹脂吸附法[17-19,23-24,27]、凝膠色譜法[16,19-20]、高速逆流色譜法[25]及膜過濾法[35]等。

表3列舉了各分離純化方法的原理、應用實例和優(yōu)缺點。其中大孔樹脂吸附法對PCs具有良好的分離純化效果，由于操作簡單、綠色環(huán)保，適合產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)勢，目前在蓮中PCs分離純化中應用最廣。通過對樹脂靜態(tài)吸附和解吸能力的考察，AB-8、HPD-400、HPD-100、DA-201等商品大孔樹脂，由于對蓮中PCs吸附選擇性強、吸附容量高、解吸條件溫和、再生簡便等特點而得到廣泛應用。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜柱可以有效去除糖、葉綠素等色素和大多數(shù)酚類干擾物質，應用也很普遍。由表3可知，各方法在分離純化蓮中PCs應用上各有優(yōu)劣，由于粗提物成分復雜，因此綜合利用多種純化手段，最大程度地發(fā)揮各方法的優(yōu)勢進行多級純化是今后蓮中PCs分離純化的發(fā)展方向。LIU等[21]從蓮房中提取PCs，利用AB-8大孔樹脂(Φ 1.5 cm×35 cm)初步純化，以蒸餾水、50%乙醇洗脫得到大孔樹脂純化物，再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(Φ 3.2 cm×40 cm)純化，依次用蒸餾水、25%甲醇、50%甲醇、70%丙酮洗脫，獲得了較顯著純化效果，純度可達98%以上。張娣等[36]采用膜過濾法結合大孔樹脂吸附法對蓮房中PCs進行分離純化。利用PAN超濾膜獲得透過液，再經(jīng)HZ-806大孔樹脂純化，得到PCs收率在85%以上，純度達81%，是單獨使用HZ-806樹脂吸附法純度的1.3倍。由于膜分離能耗低，大孔樹脂反應條件溫和，該方法工業(yè)化應用前景廣闊。

表3 蓮中原花青素的分離純化方法
Table 3 The separation and purification methods of procyanidins in lotus

3 蓮中原花青素的檢測分析

3.1 含量檢測技術

目前對于蓮中PCs含量的測定還沒有統(tǒng)一的檢測標準方法，分光光度法、HPLC等是常用的蓮中PCs含量的測定技術，其中以分光光度法應用最為普遍，包括紫外可見分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-Vis)和近紅外分光光度法(near infrared spectrophotometry, NIR)。

UV-Vis法主要用于測定蓮中PCs的總量，一般以香草醛為顯色劑，利用原花青素A環(huán)上的間苯二酚或間苯三酚結構在強酸介質中與香草醛加合，生成有色的化合物，在500 nm下有最大吸收峰，且在一定濃度范圍內，PCs濃度與吸光值之間存在良好的線性關系。通常以甲醇作為溶劑，以兒茶素作為標準品，酸介質一般采用硫酸或鹽酸。該方法簡單快速，但特異性不強，易受到樣品中相同光譜特征的共存雜質成分的影響。CAO等[17]采用香草醛-硫酸法測定蓮子殼和蓮房中PCs的含量。取0.5 mL樣液，分別加入2.5 mL的30 mg/mL香草醛溶液及30%硫酸溶液，室溫避光反應20 min，測得蓮子殼和蓮房中PCs含量分別為44.40、91.50 mg/g干重。高亮等[25]采用香草醛-鹽酸法測定荷葉中PCs含量，其最佳測定條件為：取1.0 mL樣液，加入5 mL體積比1∶1混合的1%香草醛甲醇溶液與8%鹽酸甲醇溶液，避光條件下，30 ℃水浴加熱30 min后測定。在實際定量分析中，以1.0 mL不同濃度的兒茶素為標準品代替樣液，測定吸光度值并繪制標準曲線，計算樣品中PCs含量。香草醛-鹽酸法測定PCs含量時單體和低聚體均參加反應，測得結果比真實值偏高，而香草醛-硫酸法中，在加入硫酸時產(chǎn)生很高的熱量，會使PCs氧化發(fā)生分解，造成測定結果偏低。

NIR法利用PCs結構中的基團在近紅外光譜區(qū)特定的吸收光譜，通過建立校正模型實現(xiàn)對樣品的定量分析。該技術用于測定蓮房中PCs含量，建模所需樣品數(shù)量多，將蓮房樣品通過30目篩，以紫外-可見分光光度法為對照方法，通過二階導數(shù)和Savitzky-Golay平滑濾波處理，選取7 500～6 900 cm-1波段，運用偏最小二乘法建立蓮房中PCs含量與NIR法光譜之間的多元校正模型，實現(xiàn)對PCs含量的快速測定[37]。NIR法具有樣品預處理簡單，快速、無損的優(yōu)點，但準確度不如經(jīng)典分析方法，應用較少。

HPLC適用于極性強、不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定組分分析，根據(jù)PCs不同組分在固定相和流動相中吸附或分配系數(shù)的差異達到分離的目的。該方法可串聯(lián)多種檢測器，包括二極管陣列檢測器(diode array detector, DAD)、紫外檢測器(UV detector, UVD)、四極桿質譜檢測器(MS)、三重四極桿質譜檢測器(MS/MS)等，可用于蓮中PCs單體組成及含量的檢測[5,9,21]，具有高效、精準等特點，是未來含量測定的理想方法，常采用C18色譜柱對PCs進行分離。童錫迪等[38]采用HPLC-DAD法測定蓮子殼提取物中PCs含量，樣品采用甲醇超聲提取后，進行水解反應，用Diamonsil C18柱分離，以V(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)∶V(異丙醇)=13∶73∶8∶6為流動相洗脫分離，在525 nm下測定，該方法的線性范圍為37.6～300.8 μg/mL，加標回收率為99.2%，相對標準偏差為0.30%，檢出限和定量限分別可達16.6、50.5 μg/mL。由于PCs是一類性質極為相近的聚合物組成的混合物，受標準品的種類以及色譜分離能力的限制，HPLC只能分離PCs中十分有限的主要成分，很難對全部的PCs單體組成及含量進行測定。

3.2 結構分析技術

PCs的結構分析方法很多，包括電噴霧電離質譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)，HPLC-三重四桿串聯(lián)質譜(HPLC triple quadrupole tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)，HPLC-四極桿飛行時間質譜(HPLC quadrupole time-of-flight mass spectrometry, HPLC-QTOF-MS)，傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)，核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)等方法[5,17-19,21,23-24]，由于PCs結構組分復雜，需借助多種手段才能解析其結構。在PCs結構分析中，對已分離純化的PCs可用MS的準分子離子、碎片離子和多種加合電荷離子等確定分子質量和分子式，利用FTIR確定特征官能團結構，利用NMR提供組成分子的碳氫骨架信息。LIU等[21]利用HPLC-DAD和HPLC-QTOF-MS分析蓮房中PCs組分構成，鑒定出11種PCs成分，均以C、EC、GC、EGC為組成單元，分別為EC/C、EGC/GC、B2/B3異構體、B1/B4異構體、A1/A2、(EC/C)-O-(EGC/GC)、(B1/B4)-(EC/C)、(EGC/GC)-(EGC/GC)、(B2/B3)-(EGC/GC)異構體、(B2/B3)-(EC/C)異構體和(EGC/GC)-O-(EGC/GC)-O-(EGC/GC)。此外，余修亮[23]利用FTIR技術在4 000～500 cm-1波段對蓮房和蓮殼提取物中PCs結構進行分析，圖譜顯示，3 423.5 cm-1處有吸收，判斷存在酚羥基，而1 616.2、1 447.5 cm-1處有吸收表明存在苯環(huán)骨架，此外，1 294.8、902.2 cm-1有吸收峰，表明有吡喃環(huán)構型。李綺麗等[39]采用大孔樹脂AB-8和聚酰胺柱對紅蓮外皮中PCs粗提取物進行純化，用IR、ESI-MS和HPLC-MS/MS進行成分分析，確認純化物中含有9種PCs單體和低聚體，其中包括C、EC(m/z 289)、GC(m/z 305)3種單體，4種原花青定二聚體同分異構體(m/z 577)和2種原花青定四聚體同分異構體(m/z 1 153)。

表4總結了蓮中PCs常用結構分析技術的原理及優(yōu)缺點。在對PCs進行分結構分析時，應針對不同的目的選擇恰當?shù)姆治龇椒ā?/p>

表4 蓮中PCs常用結構分析技術比較
Table 4 The comparison of commonly used structural analysis techniques of PCs in lotus

4 蓮原花青素在食品中的應用

4.1 抑制食品油脂氧化

油脂是食品中主要的化學成分之一，在貯藏過程中油脂容易發(fā)生氧化，不僅影響食物感官，降低營養(yǎng)價值，還會產(chǎn)生一些過氧化物、醛類、酮類等有毒有害物質導致人體衰老、癌癥以及多種慢性疾病的發(fā)生。添加抗氧化劑是目前采取的抑制食品油脂氧化的主要手段。研究顯示，蓮原花青素可以很好地抑制脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)的活性[40]，當與金屬離子螯合后，對LOX活性的抑制能力更高[41]，從而有效抑制油脂的自動氧化，是一種優(yōu)良的油脂天然抗氧化劑。李肖朋等[42]發(fā)現(xiàn)蓮原花青素低聚體(lotus oligomeric proantho cyanidins, LSOPC)可以延緩菜籽油的氧化，在添加量為0.05%的條件下，其抗氧化效果與合成抗氧化劑二叔丁基羥基甲苯相當，但是LSOPC酚羥基較多脂溶性較差，在油脂體系中的應用一定程度上受到限制。石嘉懌等[43]對LSOPC進行硬脂酰氯改性修飾，并對其在油脂儲藏及冷卻肉保鮮中的應用進行了研究。結果表明，經(jīng)過硬脂酰氯改性，LSOPC脂溶性得到提高，更容易分散于油脂體系中，抗油脂氧化能力顯著增強，對冷卻豬肉的保鮮效果更佳，但在一定程度上會造成冷卻豬肉失色。李欣等[44]發(fā)現(xiàn)蓮房原花青素(lotus seedpod procyanidins, LSPC)能夠延緩冷鮮牛肉亮度值、紅度值、氧合肌紅蛋白含量的降低，抑制高鐵肌紅蛋白含量、酸價及硫代巴比妥酸值升高，顯著改善冷鮮牛肉色澤，抑制脂肪氧化，且當含量為0.08%時，護色和抗脂肪氧化效果最佳。此外，向面包中添加少量蓮原花青素，可以顯著增加面包清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的能力，提高面包的抗氧化活性，延緩淀粉在體內的消化速率，但會在一定程度上降低面包的比容，增加面包的硬度，使面包的食用品質受到影響[45]。

4.2 控制食品中有害物質生成

亞硝酸鹽(nitrite, NIT)是強致癌物N-亞硝胺前體，作為食品、尤其是腌制食品中人們高度關注的有害物質之一，控制其在食品中產(chǎn)生和含量是保證食品安全的重要環(huán)節(jié)。肖珍等[46]研究了LSPC對紫甘藍泡菜中NIT的抑制作用。他們在模擬發(fā)酵條件下測定了LSPC對NIT的清除率和對亞硝胺合成的阻斷率，發(fā)現(xiàn)LSPC對NIT清除率可達81.15%，對亞硝胺合成阻斷率可達80.29%。在發(fā)酵液中添加0.01% LSPC后，泡菜中NIT含量降低45.5%，表明LSPC通過阻斷亞硝胺合成，可顯著降低泡菜中NIT含量，同時發(fā)現(xiàn)添加LSPC能提高泡菜的抗氧化能力，保持紫甘藍泡菜中的還原糖和色澤，但會延長泡菜的發(fā)酵時間，降低泡菜的總酸含量。

食品在熱加工過程中不可避免地發(fā)生Maillard反應，即非酶促條件下羰基化合物和氨基化合物之間發(fā)生反應生成棕色甚至黑色物質，它在賦予食品誘人的色澤與風味的同時，也產(chǎn)生了丙烯酰胺(acrylamide, AM)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)等有毒有害物質。研究顯示，LSOPC是AGEs天然抑制劑，在乳糖-賴氨酸體系中，LSOPC對AGEs生成具有抑制作用，而且受加熱溫度和時間影響顯著，其抑制機理可能為消除自由基、抗氧化、封閉活性羰基[47]。LSPC也被證明在抗AM生成方面具有顯著的效果。陳媛媛等[48]研究發(fā)現(xiàn)LSPC能有效抑制薯條、油條等油炸食品中AM的形成，當薯條和油條浸漬時間分別為90 s和60 s，LSPC添加量分別為0.5%(質量分數(shù))和0.1%(質量分數(shù))時，對AM的抑制率分別達到57.59%和67.38%，此時感官上與對照組并無顯著差別。LSPC對AM的抑制可能是因為其抗氧化性，通過抑制AM形成過程中主要的前體物質N-葡基胺的轉化，從而抑制AM的產(chǎn)生。而且LSPC對AM的抑制作用主要表現(xiàn)在抑制AM的形成過程，對生成后的AM并無抑制作用表現(xiàn)[49]。

4 總結與展望

經(jīng)過多年的研究與探索，國內外關于蓮中PCs的組分構成、提取分離、檢測分析及在食品中應用等方面的研究取得了一定進展。從本文綜述可見，蓮中含有較豐富的PCs，以在蓮房中含量最高，且以B型二聚體為主。在提取分離蓮中PCs時，當前主要采用以乙醇溶液為提取劑的溶劑提取法和大孔樹脂吸附法，通過將不同方法適當組合結合能夠達到更理想的提取分離效果。在蓮中PCs含量測定方法中，以香草醛-鹽酸法和香草醛-硫酸法最為常用，但它們只能用于總量測定，無法有效測定PCs各單體含量，HPLC串聯(lián)不同檢測器可用于檢測PCs不同單體含量，且具有高效、精準等特點，是未來理想的含量測定方法，在結構分析方法中，很難通過單一方法實現(xiàn)PCs結構解析，需借助液相色譜質譜聯(lián)用、FTIR、NMR等多種方法才能解析得到可靠結果。此外，蓮原花青素具有天然抗氧化活性功能，能有效抑制食品油脂氧化，并對食品中NIT、AM、AGEs等有害物質形成具有抑制作用，在食品安全控制中展現(xiàn)出良好的應用前景。然而，目前對蓮中PCs的研究還存一些問題，主要表現(xiàn)在：蓮中PCs種類多、結構復雜，不易于結構表征，空間構型研究還不充分，不同組分間的活性差異研究亟待深入；提取分離純化工藝及含量測定研究尚不足，缺乏統(tǒng)一的技術標準；實際應用缺乏廣度和深度，產(chǎn)品開發(fā)仍處于初級階段；潛在的毒性危害仍然未知，需通過長時間的急性、慢性毒理學實驗進行評價。針對上述問題，未來應進一步加強對蓮中PCs提取分離工藝方面的研究，簡化生產(chǎn)工藝并提升得率水平，形成科學標準的檢測體系，探索并優(yōu)化結構分析手段，明確蓮中更多PCs的空間構型，并對蓮原花青素進行系統(tǒng)開發(fā)和綜合利用，拓展應用廣度，提高應用深度，同時重視對蓮中PCs的毒理學研究，加強安全性方面的評價，確保其在實際應用中的安全性。此外，蓮中PCs含量有限，高原花青素的蓮種質資源的發(fā)掘也具有重要的研究意義和價值。因此，未來對于蓮中PCs的研究仍有大量的工作要做。