基于營(yíng)養(yǎng)元素的莖瘤芥主成分分析和產(chǎn)地溯源
莖瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)又名青菜頭,為十字花科蕓薹屬莖用芥菜,是我國(guó)長(zhǎng)江流域重要的農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)作物,作為主要原料腌制而成的涪陵榨菜,與法國(guó)酸黃瓜和德國(guó)甜酸甘藍(lán)被譽(yù)為世界三大名腌菜[1]。莖瘤芥表皮青綠,肉質(zhì)白嫩肥厚,富含蛋白質(zhì)、糖分、胡蘿卜素、氨基酸、核黃素以及多種維生素等人體所必需的營(yíng)養(yǎng)成分,具有鮮嫩香脆的獨(dú)特風(fēng)味[2-4]。莖瘤芥主產(chǎn)于我國(guó)重慶、四川等地,浙江和江蘇也有大面積種植,而四川和重慶的生態(tài)環(huán)境和氣候條件最適宜莖瘤芥栽培,所形成的瘤狀肉質(zhì)莖尤為肥嫩。莖瘤芥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不僅取決于其有機(jī)成分,而且與其所含營(yíng)養(yǎng)元素密切相關(guān),作為莖瘤芥生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ),營(yíng)養(yǎng)元素是莖瘤芥組織發(fā)育、維持和代謝所需的重要物質(zhì),也是人們通過(guò)食用莖瘤芥獲取必需微量元素的重要來(lái)源。因此,建立適用于涵蓋莖瘤芥中常量和微量營(yíng)養(yǎng)元素的分析方法,并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)等方法進(jìn)行模式識(shí)別分析,有利于正確評(píng)價(jià)莖瘤芥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,通過(guò)探尋莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素含量的特征指標(biāo),有利于莖瘤芥品種保護(hù)和產(chǎn)地溯源。
目前,有關(guān)莖瘤芥的研究主要集中于遺傳育種和生理性狀[5-7],而對(duì)于莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素含量分布的研究報(bào)道不多。莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素含量不僅受遺傳基因控制,而且與產(chǎn)地環(huán)境如土壤、氣候、水質(zhì)、栽培條件、施肥方法等因素相關(guān),因此,不同產(chǎn)地莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的組成差異能反映莖瘤芥的品質(zhì)及其產(chǎn)地特征。通過(guò)化學(xué)分析方法獲取植物中無(wú)機(jī)元素的組成和含量,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)元素特征進(jìn)行模式識(shí)別分析,可用于植物的品質(zhì)評(píng)價(jià)和產(chǎn)地判別,達(dá)到植物資源原產(chǎn)地保護(hù)的目的,已廣泛應(yīng)用于花椒、山銀花、薰衣草、小麥、花茶等多種植物資源產(chǎn)地溯源的研究與應(yīng)用[8-12]。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma optical emission spectrometry,ICP-OES)超高基質(zhì)耐受能力可在較大濃度范圍內(nèi)進(jìn)行植物資源中多種常量和微量元素的高通量分析,且具有高靈敏度、檢測(cè)速度快和較低檢測(cè)限等特點(diǎn)而備受青睞[13-15]。多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)可以針對(duì)多個(gè)互相關(guān)聯(lián)的對(duì)象和指標(biāo)分析目標(biāo)樣品的統(tǒng)計(jì)規(guī)律,其中主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類(lèi)分析(cluster analysis,CA)是常見(jiàn)的統(tǒng)計(jì)分析方法[16-18]。本研究選擇產(chǎn)自重慶涪陵、四川沱江和湖南瀏陽(yáng)的莖瘤芥作為研究對(duì)象,具有較強(qiáng)代表性及地域特色,莖瘤芥樣品經(jīng)微波消解后采用ICP-OES測(cè)定其中常量營(yíng)養(yǎng)元素(Mg、P、S、Ca、K)和微量營(yíng)養(yǎng)元素(B、Mo、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr)的含量,繼而利用PCA技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地莖瘤芥中的營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)行判別分析,并對(duì)不同產(chǎn)地的關(guān)鍵差異性營(yíng)養(yǎng)元素采用CA技術(shù)進(jìn)行聚類(lèi),以期為莖瘤芥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)提供依據(jù),通過(guò)探尋莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素含量的特征指標(biāo),為莖瘤芥的產(chǎn)地溯源提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
16個(gè)莖瘤芥樣品在2021年1月分別采集于重慶涪陵(東經(jīng)107°29′56″,北緯29°50′10″,海撥225~418 m)、四川沱江(東經(jīng) 104°78′15″,北緯29°28′25″,海撥270~350 m)和湖南瀏陽(yáng)(東經(jīng)113°60′22″,北緯28°01′56″,海撥202~369 m),其中重慶涪陵6個(gè),四川沱江6個(gè),湖南瀏陽(yáng)4個(gè)。
1 000 mg/L的Mg、P、S、Ca、K、B、Mo、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;65%(體積分?jǐn)?shù))硝酸、30%(體積分?jǐn)?shù))雙氧水,德國(guó)Merck公司;胡蘿卜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10047),中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所;實(shí)驗(yàn)用水為Milli超純水。
1.2 儀器與設(shè)備
Agilent 5110電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀,配備SeaSpray霧化器、單通道玻璃旋流霧化室和SPS 4自動(dòng)進(jìn)樣器,美國(guó)Agilent公司;MARs 5微波消解系統(tǒng),美國(guó)CEM公司;泰斯特FZ102微型植物粉碎機(jī),天津泰斯特儀器有限公司;Milli-Q超純水機(jī),美國(guó)Millipore公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 ICP-OES工作條件
射頻功率,1.5 kW;等離子體流量,12 L/min;霧化氣流量,0.6 L/min;輔助氣流量,1.0 L/min;觀測(cè)高度,8 mm;泵速,15 r/min;讀數(shù)時(shí)間,20 s;重復(fù)次數(shù),3次;樣品提升延遲時(shí)間,20 s;穩(wěn)定時(shí)間,20 s;背景校正,快速自動(dòng)曲線擬合技術(shù)。
1.3.2 樣品微波消解
將采集的新鮮莖瘤芥樣品經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后用超純水清洗3次,瀝干水分于80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重,粉碎過(guò)40目篩。準(zhǔn)確稱(chēng)取約0.2 g粉末樣品于微波消解反應(yīng)罐內(nèi),加入8 mL硝酸預(yù)反應(yīng)30 min后按微波消解儀推薦程序進(jìn)行消解。消解結(jié)束后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中,加入2 mL雙氧水,用超純水定容至刻度,搖勻后制得樣品溶液。采用相同的消解方式處理標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白溶液。
1.3.3 ICP-OES分析
采用單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別配制0.0、2.0、10、50、200 mg/L的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液,按所設(shè)定的條件分別對(duì)工作標(biāo)準(zhǔn)溶液、消解空白溶液和樣品消解溶液進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品溶液中營(yíng)養(yǎng)元素的含量。
1.3.4 數(shù)據(jù)處理
運(yùn)用ICP-OES自帶的ICP Expert 軟件對(duì)16個(gè)莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用SPSS 26對(duì)ICP-OES分析數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 ICP-OES分析性能評(píng)價(jià)
2.1.1 方法的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)與檢出限
采用ICP-OES對(duì)系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。通過(guò)連續(xù)測(cè)定11次消解空白溶液中分析元素的發(fā)射強(qiáng)度,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ),以3σ所對(duì)應(yīng)的濃度為分析元素儀器的檢出限,經(jīng)稀釋校正計(jì)算分析元素方法的檢出限(method detection limit,MDL),分析元素的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)與檢出限見(jiàn)表1??梢钥闯?,所有分析元素的線性相關(guān)系數(shù)大于0.999 5,線性關(guān)系良好;本法的MDL為0.01~1.38 mg/kg,除S以外,其余所有分析元素的MDL均低于我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.268—2016)采用ICP-OES法制定的規(guī)定值[19]。
表1 元素的分析波長(zhǎng)、校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)及方法的檢出限
Table 1 Analysis results of national standard reference materials
2.1.2 方法準(zhǔn)確性與精密度驗(yàn)證
應(yīng)用有證國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)胡蘿卜(GBW10047)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和精密度,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)微波消解后重復(fù)測(cè)定6次,結(jié)果見(jiàn)表2??梢钥闯?,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的認(rèn)證值,本法的測(cè)定值與認(rèn)定值相吻合,相對(duì)誤差(relative error,RE)為-3.0%~3.9%,回收率為97.0%~104%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為1.3%~4.1%。良好的回收率和RSD驗(yàn)證了方法能準(zhǔn)確測(cè)定莖瘤芥中的12種營(yíng)養(yǎng)元素,具有高精密度。
表2 方法的準(zhǔn)確性和精密度評(píng)價(jià)(n=6)
Table 2 Accuracy and precision evaluation of the method(n=6)
2.2 莖瘤芥樣品分析
采用本方法分別測(cè)定了來(lái)自重慶涪陵(樣品編號(hào)CQFL1~6)、四川沱江(樣品編號(hào)SCTJ1~6)和湖南瀏陽(yáng)(樣品編號(hào)HNLY1~4)的16個(gè)莖瘤芥樣品,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次,結(jié)果見(jiàn)表3。不同產(chǎn)地莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的含量差別很大,莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的含量不僅受控于其遺傳特性,而且與其生長(zhǎng)地理環(huán)境和栽培條件等因素有關(guān)。16個(gè)莖瘤芥樣品中Mg的含量為997~3 350 mg/kg,P的含量為726~17 200 mg/kg,S的含量為390~8 350 mg/kg,Ca的含量為812~11 900 mg/kg,K的含量為4 360~78 300 mg/kg,B的含量為2.12~40.6 mg/kg,Mo的含量為0.02~0.68 mg/kg,Mn的含量為2.25~90.5 mg/kg,F(xiàn)e的含量為11.0~166 mg/kg,Cu為含量在0.46~16.4 mg/kg,Zn的含量在1.61~69.0 mg/kg,Sr的含量為0.20~5.38 mg/kg。其中重慶涪陵莖瘤芥樣品中Mg、P、S、Ca、K、B、Mn、Fe、Zn的含量顯著高于其他2個(gè)產(chǎn)區(qū),而四川沱江莖瘤芥樣品中Mg、P、S、K、B、Mn的含量相差不大,四川沱江莖瘤芥樣品中Ca、Fe、Zn的含量低于湖南瀏陽(yáng)莖瘤芥樣品;重慶涪陵莖瘤芥樣品中Mo和Sr的含量顯著低于其他2個(gè)產(chǎn)區(qū),四川沱江莖瘤芥樣品中Mo的含量高于湖南瀏陽(yáng)莖瘤芥樣品;湖南瀏陽(yáng)莖瘤芥樣品中Cu的含量高于其他2個(gè)產(chǎn)區(qū),重慶涪陵莖瘤芥樣品中Cu的含量高于四川沱江莖瘤芥樣品。
表3 莖瘤芥樣品的分析結(jié)果(n=6) 單位:mg/kg
Table 3 Analysis results of tumorous stem mustard (Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee)(n=6)
2.3 PCA
2.3.1 莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的相關(guān)性分析
由于莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素繁多,且受莖瘤芥產(chǎn)地、氣候、季節(jié)等其他因素的影響,很難通過(guò)利用簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)分析獲取有效變量。PCA是將多維度的原始變量通過(guò)降低維度,重新組合成相互無(wú)關(guān)的綜合變量來(lái)反映原始變量的統(tǒng)計(jì)方法,原始數(shù)據(jù)的相關(guān)性越高,PCA效果越好[20-22]。本實(shí)驗(yàn)采用KMO(Kaiser-Meyer-Olkin)和Bartlett 的球形度對(duì)莖瘤芥中12種營(yíng)養(yǎng)元素(變量)之間的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn),考察原始變量是否合適進(jìn)行因子分析。檢驗(yàn)結(jié)果顯示,KMO為0.724,大于閾值0.5,Bartlett球形度檢驗(yàn)的顯著性(significance,Sig.)為0.000,小于0.05,說(shuō)明莖瘤芥中12個(gè)變量之間具有相關(guān)性,可以進(jìn)行因子分析。
通過(guò)分析莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的相關(guān)性矩陣(表4)發(fā)現(xiàn),莖瘤芥對(duì)多種營(yíng)養(yǎng)元素具有顯著正相關(guān)(P<0.05),多數(shù)處于極顯著正相關(guān)(P<0.01)。Mg、P、S、Ca、K、B、Mn、Fe、Zn之間呈極顯著正相關(guān),表明這些營(yíng)養(yǎng)元素存在相互協(xié)同、促進(jìn)吸收的關(guān)系,同時(shí)顯示出莖瘤芥在富集以上營(yíng)養(yǎng)元素時(shí)具有極好的協(xié)同效應(yīng),但其含量差異與莖瘤芥的品種、生長(zhǎng)環(huán)境等因素相關(guān);Mo和Sr與多數(shù)營(yíng)養(yǎng)元素之間呈極顯著負(fù)相關(guān),表明Mo和Sr與這些營(yíng)養(yǎng)元素之間存在相互拮抗關(guān)系;Cu與部分營(yíng)養(yǎng)元素相關(guān)性較差,說(shuō)明Cu元素的差異可能主要源于產(chǎn)區(qū)土壤的差異。不同產(chǎn)區(qū)的莖瘤芥樣品由于含有相同的生長(zhǎng)基因,從土壤中吸收并最終積累在莖瘤芥內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)元素在種類(lèi)和含量分布會(huì)存在一定規(guī)律,但不同產(chǎn)地莖瘤芥的營(yíng)養(yǎng)元素存在較大差異,可能與土壤類(lèi)型、氣候條件等因素相關(guān),同時(shí),莖瘤芥的個(gè)體差異對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和積累也不盡相同,但莖瘤芥中12種營(yíng)養(yǎng)元素之間是相互影響的機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。
表4 莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的相關(guān)性矩陣
Table 4 Correlation matrix for the nutrient elements in tumorous stem mustard
注:“**”表示極顯著相關(guān)(P<0.01);“*”表示顯著相關(guān)(P<0.05)
2.3.2 莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的因子分析
對(duì)莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素含量原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后,采用PCA提取公因子,進(jìn)行因子分析。前2個(gè)公因子的累積方差貢獻(xiàn)率分別為73.740%和12.231%,累積貢獻(xiàn)率達(dá)到85.971%。因此,本實(shí)驗(yàn)提取第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)來(lái)評(píng)判莖瘤芥營(yíng)養(yǎng)元素的總體特征。采用最大方差法對(duì)因子載荷矩陣旋轉(zhuǎn),構(gòu)建PC1和PC2的數(shù)據(jù)得分模型:
PC1=0.867x1+0.921x2+0.953x3+0.653x4+0.940x5+0.934x6-0.464x7+0.918x8+0.650x9-0.029x10+0.885x11-0.609x12
PC2=0.246x1+0.275x2+0.241x3+0.662x4+0.249x5+0.168x6-0.787x7+0.213x8+0.474x9+0.982x10+0.329x11-0.552x12
2個(gè)主成分的數(shù)據(jù)得分模型顯示,PC1在x1、x2、x3、x5、x6、x8、x11有較大荷載值(>0.800),對(duì)應(yīng)元素為Mg、P、S、K、B、Mn、Zn,PC2在x10有較大荷載值,與元素Cu相對(duì)應(yīng)。由于PC1和PC2能代表莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的大部分原始信息,因此,所對(duì)應(yīng)的高度正相關(guān)元素Mg、P、S、K、B、Mn、Zn、Cu為莖瘤芥的特征元素。
圖1所示為16個(gè)莖瘤芥樣品主成分(或主因子)的PCA得分圖,圖中的每個(gè)樣品分布點(diǎn)均為原12維空間的樣品點(diǎn)經(jīng)降維映射而來(lái),反映出16個(gè)莖瘤芥樣品的分類(lèi)情況??梢钥闯?,3種不同產(chǎn)地的莖瘤芥樣品可以明顯分成三大類(lèi),產(chǎn)于重慶涪陵的莖瘤芥樣品(樣品分布點(diǎn)1~6)分成一類(lèi),產(chǎn)于四川沱江的莖瘤芥樣品(樣品分布點(diǎn)7~12)分成一類(lèi),產(chǎn)于湖南瀏陽(yáng)的莖瘤芥樣品(樣品分布點(diǎn)13~16)分成一類(lèi),莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的含量能將不同產(chǎn)地的莖瘤芥樣品進(jìn)行有效區(qū)分,可用于莖瘤芥產(chǎn)地的判別。
2.4 聚類(lèi)分析
本實(shí)驗(yàn)采用系統(tǒng)CA對(duì)不同產(chǎn)地莖瘤芥樣品進(jìn)行聚類(lèi),以12種營(yíng)養(yǎng)元素含量為變量,CA采用組間連接法和歐氏距離平方,聚類(lèi)樹(shù)狀圖見(jiàn)圖2。當(dāng)距離選擇7時(shí),16個(gè)樣品分為兩類(lèi),重慶涪陵產(chǎn)地的莖瘤芥歸為一類(lèi),四川沱江和湖南瀏陽(yáng)產(chǎn)地的莖瘤芥歸為一類(lèi),表明涪陵產(chǎn)地與外地的莖瘤芥存在較大差異;距離選擇5時(shí),16個(gè)樣品分為三類(lèi),能較好地將四川沱江和湖南瀏陽(yáng)產(chǎn)地的莖瘤芥正確歸類(lèi)。結(jié)果表明以12種營(yíng)養(yǎng)元素為原始變量能對(duì)莖瘤芥的產(chǎn)地進(jìn)行溯源。
圖1 樣品的PCA得分圖
Fig.1 PCA score chart of samples
圖2 莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素含量的聚類(lèi)樹(shù)狀圖
Fig.2 Cluster dendrogram of nutrient element content in tumorous stem mustard
3 結(jié)論
采用ICP-OES法能有效分析莖瘤芥樣品中的常量營(yíng)養(yǎng)元素(Mg、P、S、Ca、K)和微量營(yíng)養(yǎng)元素(B、Mo、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr),可準(zhǔn)確評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地莖瘤芥的營(yíng)養(yǎng)元素含量,不同產(chǎn)地莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的含量差別很大;通過(guò)PCA進(jìn)行莖瘤芥產(chǎn)地與其營(yíng)養(yǎng)元素含量之間的相關(guān)性研究,確定高度正相關(guān)元素Mg、P、S、K、B、Mn、Zn、Cu為莖瘤芥的特征元素;由PCA構(gòu)建的2個(gè)主成分?jǐn)?shù)據(jù)得分模型,可以將重慶涪陵、四川沱江和湖南瀏陽(yáng)3個(gè)產(chǎn)地的莖瘤芥區(qū)分;由CA進(jìn)行莖瘤芥產(chǎn)地與營(yíng)養(yǎng)元素含量的判別分析,對(duì)莖瘤芥產(chǎn)地的判別結(jié)果與PCA相吻合,可根據(jù)莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素的含量差異進(jìn)行產(chǎn)地溯源。因此,通過(guò)對(duì)莖瘤芥中營(yíng)養(yǎng)元素含量的測(cè)定,運(yùn)用PCA和CA可以區(qū)分莖瘤芥產(chǎn)地來(lái)源,研究結(jié)果為莖瘤芥產(chǎn)地的判別研究提供了快速、準(zhǔn)確、可靠的統(tǒng)計(jì)分析方法。
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