基于營養(yǎng)元素的莖瘤芥主成分分析和產地溯源

莖瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)又名青菜頭，為十字花科蕓薹屬莖用芥菜，是我國長江流域重要的農業(yè)和經濟作物，作為主要原料腌制而成的涪陵榨菜，與法國酸黃瓜和德國甜酸甘藍被譽為世界三大名腌菜[1]。莖瘤芥表皮青綠，肉質白嫩肥厚，富含蛋白質、糖分、胡蘿卜素、氨基酸、核黃素以及多種維生素等人體所必需的營養(yǎng)成分，具有鮮嫩香脆的獨特風味[2-4]。莖瘤芥主產于我國重慶、四川等地，浙江和江蘇也有大面積種植，而四川和重慶的生態(tài)環(huán)境和氣候條件最適宜莖瘤芥栽培，所形成的瘤狀肉質莖尤為肥嫩。莖瘤芥的營養(yǎng)價值不僅取決于其有機成分，而且與其所含營養(yǎng)元素密切相關，作為莖瘤芥生長的物質基礎，營養(yǎng)元素是莖瘤芥組織發(fā)育、維持和代謝所需的重要物質，也是人們通過食用莖瘤芥獲取必需微量元素的重要來源。因此，建立適用于涵蓋莖瘤芥中常量和微量營養(yǎng)元素的分析方法，并利用化學計量學等方法進行模式識別分析，有利于正確評價莖瘤芥的營養(yǎng)價值，通過探尋莖瘤芥中營養(yǎng)元素含量的特征指標，有利于莖瘤芥品種保護和產地溯源。

目前，有關莖瘤芥的研究主要集中于遺傳育種和生理性狀[5-7]，而對于莖瘤芥中營養(yǎng)元素含量分布的研究報道不多。莖瘤芥中營養(yǎng)元素含量不僅受遺傳基因控制，而且與產地環(huán)境如土壤、氣候、水質、栽培條件、施肥方法等因素相關，因此，不同產地莖瘤芥中營養(yǎng)元素的組成差異能反映莖瘤芥的品質及其產地特征。通過化學分析方法獲取植物中無機元素的組成和含量，結合化學計量學方法對元素特征進行模式識別分析，可用于植物的品質評價和產地判別，達到植物資源原產地保護的目的，已廣泛應用于花椒、山銀花、薰衣草、小麥、花茶等多種植物資源產地溯源的研究與應用[8-12]。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES)超高基質耐受能力可在較大濃度范圍內進行植物資源中多種常量和微量元素的高通量分析，且具有高靈敏度、檢測速度快和較低檢測限等特點而備受青睞[13-15]。多元統(tǒng)計分析技術可以針對多個互相關聯(lián)的對象和指標分析目標樣品的統(tǒng)計規(guī)律，其中主成分分析(principal component analysis，PCA)和聚類分析(cluster analysis，CA)是常見的統(tǒng)計分析方法[16-18]。本研究選擇產自重慶涪陵、四川沱江和湖南瀏陽的莖瘤芥作為研究對象，具有較強代表性及地域特色，莖瘤芥樣品經微波消解后采用ICP-OES測定其中常量營養(yǎng)元素(Mg、P、S、Ca、K)和微量營養(yǎng)元素(B、Mo、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr)的含量，繼而利用PCA技術對不同產地莖瘤芥中的營養(yǎng)元素進行判別分析，并對不同產地的關鍵差異性營養(yǎng)元素采用CA技術進行聚類，以期為莖瘤芥的營養(yǎng)價值評價提供依據，通過探尋莖瘤芥中營養(yǎng)元素含量的特征指標，為莖瘤芥的產地溯源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

16個莖瘤芥樣品在2021年1月分別采集于重慶涪陵(東經107°29′56″，北緯29°50′10″，海撥225～418 m)、四川沱江(東經 104°78′15″，北緯29°28′25″，海撥270～350 m)和湖南瀏陽(東經113°60′22″，北緯28°01′56″，海撥202～369 m)，其中重慶涪陵6個，四川沱江6個，湖南瀏陽4個。

1 000 mg/L的Mg、P、S、Ca、K、B、Mo、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr單元素標準儲備溶液，國家標準物質中心；65%(體積分數)硝酸、30%(體積分數)雙氧水，德國Merck公司；胡蘿卜成分分析標準物質(GBW10047)，中國地質科學院地球物理地球化學勘查研究所；實驗用水為Milli超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent 5110電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀，配備SeaSpray霧化器、單通道玻璃旋流霧化室和SPS 4自動進樣器，美國Agilent公司；MARs 5微波消解系統(tǒng)，美國CEM公司；泰斯特FZ102微型植物粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ICP-OES工作條件

射頻功率，1.5 kW；等離子體流量，12 L/min；霧化氣流量，0.6 L/min；輔助氣流量，1.0 L/min；觀測高度，8 mm；泵速，15 r/min；讀數時間，20 s；重復次數，3次；樣品提升延遲時間，20 s；穩(wěn)定時間，20 s；背景校正，快速自動曲線擬合技術。

1.3.2 樣品微波消解

將采集的新鮮莖瘤芥樣品經自來水沖洗干凈后用超純水清洗3次，瀝干水分于80 ℃鼓風干燥箱中烘干至恒重，粉碎過40目篩。準確稱取約0.2 g粉末樣品于微波消解反應罐內，加入8 mL硝酸預反應30 min后按微波消解儀推薦程序進行消解。消解結束后轉入50 mL容量瓶中，加入2 mL雙氧水，用超純水定容至刻度，搖勻后制得樣品溶液。采用相同的消解方式處理標準物質、標準溶液和空白溶液。

1.3.3 ICP-OES分析

采用單元素標準儲備溶液分別配制0.0、2.0、10、50、200 mg/L的工作標準溶液，按所設定的條件分別對工作標準溶液、消解空白溶液和樣品消解溶液進行測定，計算樣品溶液中營養(yǎng)元素的含量。

1.3.4 數據處理

運用ICP-OES自帶的ICP Expert 軟件對16個莖瘤芥中營養(yǎng)元素的含量數據進行處理，采用SPSS 26對ICP-OES分析數據標準化處理后進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 ICP-OES分析性能評價

2.1.1 方法的校準數據與檢出限

采用ICP-OES對系列工作標準溶液進行測定，建立標準曲線方程。通過連續(xù)測定11次消解空白溶液中分析元素的發(fā)射強度，計算標準偏差(σ)，以3σ所對應的濃度為分析元素儀器的檢出限，經稀釋校正計算分析元素方法的檢出限(method detection limit，MDL)，分析元素的校準數據與檢出限見表1?？梢钥闯觯蟹治鲈氐木€性相關系數大于0.999 5，線性關系良好；本法的MDL為0.01～1.38 mg/kg，除S以外，其余所有分析元素的MDL均低于我國食品安全國家標準(GB 5009.268—2016)采用ICP-OES法制定的規(guī)定值[19]。

表1 元素的分析波長、校準曲線數據及方法的檢出限
Table 1 Analysis results of national standard reference materials

2.1.2 方法準確性與精密度驗證

應用有證國家標準物質胡蘿卜(GBW10047)驗證方法的準確性和精密度，標準物質經微波消解后重復測定6次，結果見表2?？梢钥闯觯瑢φ諛藴蕝⒖嘉镔|的認證值，本法的測定值與認定值相吻合，相對誤差(relative error，RE)為-3.0%～3.9%，回收率為97.0%～104%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為1.3%～4.1%。良好的回收率和RSD驗證了方法能準確測定莖瘤芥中的12種營養(yǎng)元素，具有高精密度。

表2 方法的準確性和精密度評價(n=6)
Table 2 Accuracy and precision evaluation of the method(n=6)

2.2 莖瘤芥樣品分析

采用本方法分別測定了來自重慶涪陵(樣品編號CQFL1～6)、四川沱江(樣品編號SCTJ1～6)和湖南瀏陽(樣品編號HNLY1～4)的16個莖瘤芥樣品，每個樣品重復測定6次，結果見表3。不同產地莖瘤芥中營養(yǎng)元素的含量差別很大，莖瘤芥中營養(yǎng)元素的含量不僅受控于其遺傳特性，而且與其生長地理環(huán)境和栽培條件等因素有關。16個莖瘤芥樣品中Mg的含量為997～3 350 mg/kg，P的含量為726～17 200 mg/kg，S的含量為390～8 350 mg/kg，Ca的含量為812～11 900 mg/kg，K的含量為4 360～78 300 mg/kg，B的含量為2.12～40.6 mg/kg，Mo的含量為0.02～0.68 mg/kg，Mn的含量為2.25～90.5 mg/kg，Fe的含量為11.0～166 mg/kg，Cu為含量在0.46～16.4 mg/kg，Zn的含量在1.61～69.0 mg/kg，Sr的含量為0.20～5.38 mg/kg。其中重慶涪陵莖瘤芥樣品中Mg、P、S、Ca、K、B、Mn、Fe、Zn的含量顯著高于其他2個產區(qū)，而四川沱江莖瘤芥樣品中Mg、P、S、K、B、Mn的含量相差不大，四川沱江莖瘤芥樣品中Ca、Fe、Zn的含量低于湖南瀏陽莖瘤芥樣品；重慶涪陵莖瘤芥樣品中Mo和Sr的含量顯著低于其他2個產區(qū)，四川沱江莖瘤芥樣品中Mo的含量高于湖南瀏陽莖瘤芥樣品；湖南瀏陽莖瘤芥樣品中Cu的含量高于其他2個產區(qū)，重慶涪陵莖瘤芥樣品中Cu的含量高于四川沱江莖瘤芥樣品。

表3 莖瘤芥樣品的分析結果(n=6) 單位：mg/kg

Table 3 Analysis results of tumorous stem mustard (Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee)(n=6)

2.3 PCA

2.3.1 莖瘤芥中營養(yǎng)元素的相關性分析

由于莖瘤芥中營養(yǎng)元素繁多，且受莖瘤芥產地、氣候、季節(jié)等其他因素的影響，很難通過利用簡單的數據分析獲取有效變量。PCA是將多維度的原始變量通過降低維度，重新組合成相互無關的綜合變量來反映原始變量的統(tǒng)計方法，原始數據的相關性越高，PCA效果越好[20-22]。本實驗采用KMO(Kaiser-Meyer-Olkin)和Bartlett 的球形度對莖瘤芥中12種營養(yǎng)元素(變量)之間的相關性進行檢驗，考察原始變量是否合適進行因子分析。檢驗結果顯示，KMO為0.724，大于閾值0.5，Bartlett球形度檢驗的顯著性(significance，Sig.)為0.000，小于0.05，說明莖瘤芥中12個變量之間具有相關性，可以進行因子分析。

通過分析莖瘤芥中營養(yǎng)元素的相關性矩陣(表4)發(fā)現，莖瘤芥對多種營養(yǎng)元素具有顯著正相關(P<0.05)，多數處于極顯著正相關(P<0.01)。Mg、P、S、Ca、K、B、Mn、Fe、Zn之間呈極顯著正相關，表明這些營養(yǎng)元素存在相互協(xié)同、促進吸收的關系，同時顯示出莖瘤芥在富集以上營養(yǎng)元素時具有極好的協(xié)同效應，但其含量差異與莖瘤芥的品種、生長環(huán)境等因素相關；Mo和Sr與多數營養(yǎng)元素之間呈極顯著負相關，表明Mo和Sr與這些營養(yǎng)元素之間存在相互拮抗關系；Cu與部分營養(yǎng)元素相關性較差，說明Cu元素的差異可能主要源于產區(qū)土壤的差異。不同產區(qū)的莖瘤芥樣品由于含有相同的生長基因，從土壤中吸收并最終積累在莖瘤芥內的營養(yǎng)元素在種類和含量分布會存在一定規(guī)律，但不同產地莖瘤芥的營養(yǎng)元素存在較大差異，可能與土壤類型、氣候條件等因素相關，同時，莖瘤芥的個體差異對營養(yǎng)元素的吸收和積累也不盡相同，但莖瘤芥中12種營養(yǎng)元素之間是相互影響的機理仍需進一步研究。

表4 莖瘤芥中營養(yǎng)元素的相關性矩陣
Table 4 Correlation matrix for the nutrient elements in tumorous stem mustard

注：“**”表示極顯著相關(P<0.01)；“*”表示顯著相關(P<0.05)

2.3.2 莖瘤芥中營養(yǎng)元素的因子分析

對莖瘤芥中營養(yǎng)元素含量原始數據標準化后，采用PCA提取公因子，進行因子分析。前2個公因子的累積方差貢獻率分別為73.740%和12.231%，累積貢獻率達到85.971%。因此，本實驗提取第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)來評判莖瘤芥營養(yǎng)元素的總體特征。采用最大方差法對因子載荷矩陣旋轉，構建PC1和PC2的數據得分模型：

PC1=0.867x1+0.921x2+0.953x3+0.653x4+0.940x5+0.934x6-0.464x7+0.918x8+0.650x9-0.029x10+0.885x11-0.609x12

PC2=0.246x1+0.275x2+0.241x3+0.662x4+0.249x5+0.168x6-0.787x7+0.213x8+0.474x9+0.982x10+0.329x11-0.552x12

2個主成分的數據得分模型顯示，PC1在x1、x2、x3、x5、x6、x8、x11有較大荷載值(>0.800)，對應元素為Mg、P、S、K、B、Mn、Zn，PC2在x10有較大荷載值，與元素Cu相對應。由于PC1和PC2能代表莖瘤芥中營養(yǎng)元素的大部分原始信息，因此，所對應的高度正相關元素Mg、P、S、K、B、Mn、Zn、Cu為莖瘤芥的特征元素。

圖1所示為16個莖瘤芥樣品主成分(或主因子)的PCA得分圖，圖中的每個樣品分布點均為原12維空間的樣品點經降維映射而來，反映出16個莖瘤芥樣品的分類情況。可以看出，3種不同產地的莖瘤芥樣品可以明顯分成三大類，產于重慶涪陵的莖瘤芥樣品(樣品分布點1～6)分成一類，產于四川沱江的莖瘤芥樣品(樣品分布點7～12)分成一類，產于湖南瀏陽的莖瘤芥樣品(樣品分布點13～16)分成一類，莖瘤芥中營養(yǎng)元素的含量能將不同產地的莖瘤芥樣品進行有效區(qū)分，可用于莖瘤芥產地的判別。

2.4 聚類分析

本實驗采用系統(tǒng)CA對不同產地莖瘤芥樣品進行聚類，以12種營養(yǎng)元素含量為變量，CA采用組間連接法和歐氏距離平方，聚類樹狀圖見圖2。當距離選擇7時，16個樣品分為兩類，重慶涪陵產地的莖瘤芥歸為一類，四川沱江和湖南瀏陽產地的莖瘤芥歸為一類，表明涪陵產地與外地的莖瘤芥存在較大差異；距離選擇5時，16個樣品分為三類，能較好地將四川沱江和湖南瀏陽產地的莖瘤芥正確歸類。結果表明以12種營養(yǎng)元素為原始變量能對莖瘤芥的產地進行溯源。

圖1 樣品的PCA得分圖
Fig.1 PCA score chart of samples

圖2 莖瘤芥中營養(yǎng)元素含量的聚類樹狀圖
Fig.2 Cluster dendrogram of nutrient element content in tumorous stem mustard

3 結論

采用ICP-OES法能有效分析莖瘤芥樣品中的常量營養(yǎng)元素(Mg、P、S、Ca、K)和微量營養(yǎng)元素(B、Mo、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr)，可準確評價不同產地莖瘤芥的營養(yǎng)元素含量，不同產地莖瘤芥中營養(yǎng)元素的含量差別很大；通過PCA進行莖瘤芥產地與其營養(yǎng)元素含量之間的相關性研究，確定高度正相關元素Mg、P、S、K、B、Mn、Zn、Cu為莖瘤芥的特征元素；由PCA構建的2個主成分數據得分模型，可以將重慶涪陵、四川沱江和湖南瀏陽3個產地的莖瘤芥區(qū)分；由CA進行莖瘤芥產地與營養(yǎng)元素含量的判別分析，對莖瘤芥產地的判別結果與PCA相吻合，可根據莖瘤芥中營養(yǎng)元素的含量差異進行產地溯源。因此，通過對莖瘤芥中營養(yǎng)元素含量的測定，運用PCA和CA可以區(qū)分莖瘤芥產地來源，研究結果為莖瘤芥產地的判別研究提供了快速、準確、可靠的統(tǒng)計分析方法。