釀酒黃水對(duì)希瓦氏菌和假單胞菌抑菌機(jī)理的研究

黃水為棕黃色黏稠液體,由于其顏色棕黃故稱(chēng)之為黃水或黃漿水[1]。濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中,酶與酵母將酒醅中的淀粉轉(zhuǎn)化為酒精,同時(shí)生成CO2。該過(guò)程中微生物代謝的水分以及酒醅原有水分逐漸溶解酒醅中的有機(jī)酸、香味前體物等物質(zhì),最終沉積形成釀酒黃水。黃水中包括大量有機(jī)酸,其中乙酸、乳酸、丙酸、丁酸等含量較高。此外,黃水還含有酯、醇、醛等揮發(fā)性物質(zhì)以及氨基酸等成分。目前,回窖、養(yǎng)窖以及人工窖泥是常規(guī)處理方式,但無(wú)法根本解決黃水的環(huán)境污染問(wèn)題[2]。

新鮮魚(yú)類(lèi)具有高水分和高蛋白的特點(diǎn)[3],在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中易發(fā)生微生物的腐敗,水產(chǎn)品中最常見(jiàn)的致腐菌包括希瓦氏菌、明亮發(fā)光桿菌、乳酸菌和假單胞菌。張?chǎng)┑萚3]從腐敗的大黃魚(yú)魚(yú)肉中分離得到希瓦氏菌和假單胞菌,確定海水魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌。郭全友等[4]研究也認(rèn)為養(yǎng)殖大黃魚(yú)中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌。此外,蘇紅等[5]與張新林等[6]研究發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀與三文魚(yú)中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌。綜上,在有氧冷藏條件下,希瓦氏菌為多數(shù)海洋魚(yú)類(lèi)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌,假單胞菌為多數(shù)淡水魚(yú)類(lèi)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[7]。

鑒于此,本研究以希瓦氏菌和假單胞菌為研究對(duì)象,采用釀酒黃水作為生物保鮮劑,通過(guò)抑菌圈法、二倍稀釋法表征釀酒黃水對(duì)希瓦氏菌和假單胞菌生長(zhǎng)的影響,同時(shí)測(cè)定2種致腐菌的生長(zhǎng)曲線、菌體細(xì)胞膜的通透性、磷酸酶(alkline phosphatase,AKP)活性等指標(biāo),并輔以?huà)呙桦娮语@微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察黃水處理前后2種菌體的微觀形貌變化,來(lái)探索釀酒黃水對(duì)魚(yú)類(lèi)主要致腐菌生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料設(shè)備與培養(yǎng)基

希瓦氏菌,天津大學(xué)贈(zèng)予；假單胞菌(CICC 21620),中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；釀酒黃水,貴州茅臺(tái)酒廠；酵母浸粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉,北京索萊寶生物有限公司；堿性磷酸酶試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

臺(tái)式掃描電鏡(Pro),飛納；AMR-100/100T酶標(biāo)儀,奧盛儀器；XPS熒光酶標(biāo)儀,Gemini。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉5,胰蛋白胨10,氯化鈉10；固體培養(yǎng)基另外補(bǔ)充瓊脂粉20。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備菌懸液

斜面菌種接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)24 h,以2%接種量接種后二次培養(yǎng)8 h,7 000 r/min離心5 min,棄上清液,菌泥稀釋至1×106 CFU/mL,備用。

1.2.2 抑菌圈的測(cè)定

參照SHARMA等[8]的方法并稍作修改。菌懸液以1‰的接種量接種至55 ℃的半固體培養(yǎng)基中,混勻,倒入牛津杯中,待半固體凝固后,拔出牛津杯,每小孔加入5 μL相應(yīng)的液體,30 ℃培養(yǎng)24 h,游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測(cè)定

參照AL-ADHAM等[9]的方法并稍作修改。采用試管二倍梯度稀釋法：每次試驗(yàn)使用9支試管,每支試管中先加入5.0 mL的LB液體培養(yǎng)基,121 ℃滅菌20 min,編號(hào)1～9。8號(hào)為陽(yáng)性CK,只加菌液,9為陰性CK,只加釀酒黃水。1～7號(hào)試管,其中1號(hào)加入5 mL釀酒黃水,混勻后取5 mL加入2號(hào)試管,以此類(lèi)推按1∶2至1∶128稀釋,為使終液量都等于5 mL,7號(hào)和9號(hào)試管均棄5.0 mL培養(yǎng)基。1～8號(hào)試管按照2%的接種量接種,9號(hào)接種2%滅菌生理鹽水,將希瓦氏菌和假單胞菌都放在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。當(dāng)陽(yáng)性CK出現(xiàn)渾濁,而陰性CK呈現(xiàn)透明,實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效,觀察處理組的澄清情況,并進(jìn)行記錄。

1.2.4 致腐菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

參照楊昆等[10]的研究方法并稍作修改。處理組加入釀酒黃水并使其終濃度為MIC,37 ℃培養(yǎng)24 h,酶標(biāo)儀測(cè)定OD600 nm值,前12 h每隔2 h 測(cè)定1次,之后12 h測(cè)定1次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600 nm的平均值為縱坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 致腐菌核酸含量的測(cè)定

即4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),能夠與核酸結(jié)合發(fā)出熒光,且與核酸量呈正比。因此,使用熒光酶標(biāo)儀可測(cè)得胞內(nèi)和胞外核酸總量[11]。

參照繆玉佳等[12]的研究方法。按照2%的接種量,將2 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌離心處理(4 500 r/min,15 min),并用無(wú)菌水洗滌3次。用相應(yīng)MIC濃度的黃水稀釋致腐菌,30 ℃培養(yǎng)。取培養(yǎng)0、3、6、9、12、24 h的菌液各0.5 mL,加入等體積DAPI染色液,振蕩培育10 min,用熒光酶標(biāo)儀在DNA(364 nm)和RNA(400 nm)的激發(fā)波長(zhǎng)下分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,以無(wú)菌水懸浮的菌體作為CK組。

1.2.6 致腐菌紫外吸收物質(zhì)的測(cè)定

參照AL-ADHAM等[9]的研究方法并稍作修改。按照2%的接種量,將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌離心處理(4 500 r/min,15 min),并用無(wú)菌水洗滌3次。處理組：用相應(yīng)MIC的黃水稀釋致腐菌；陽(yáng)性CK組：用等體積無(wú)菌水把菌體混勻,并加入Triton×100破裂菌體。陰性CK組：用等體積無(wú)菌水把菌體混勻。3組均30 ℃培養(yǎng),分別于0、5 h取上清液,酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.2.7 致腐菌AKP酶活力的測(cè)定

洗滌對(duì)數(shù)期菌體,分別用離心前等體積的0.5MIC、1MIC、2MIC的黃水混勻菌泥,30 ℃培養(yǎng),間隔4 h取樣,4 500 r/min離心10 min,棄菌泥,留上清液,以試劑盒檢測(cè)AKP酶活力。

1.2.8 致腐菌形態(tài)的觀察

參照趙麗[13]的方法并稍作修改。向處于對(duì)數(shù)期的菌液加入MIC的釀酒黃水,充分混勻,培養(yǎng)6 h。取2 mL菌懸液,8 000 r/min,4 ℃離心5 min,棄上清液,用無(wú)菌水漂洗2次,離心收集菌泥,使用臺(tái)式掃描電子顯微鏡觀察用釀酒黃水處理過(guò)的菌體的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以(x±s)表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和t檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒黃水對(duì)2種致腐菌抑菌圈直徑的影響

釀酒黃水對(duì)希瓦氏菌和假單胞菌都具有一定的抑制作用,對(duì)希瓦氏菌的抑菌圈為(16.44±0.61)mm,對(duì)假單胞菌的抑菌圈直徑為(17.86±0.98)mm,說(shuō)明黃水對(duì)于2個(gè)菌株均有較明顯抑制生長(zhǎng)的作用,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù)開(kāi)展。

2.2 釀酒黃水對(duì)2種致腐菌MIC的影響

由表1可看出,對(duì)于海水魚(yú)主要致腐菌希瓦氏菌而言,在5號(hào)對(duì)應(yīng)的體積分?jǐn)?shù)3.13%條件下,菌株無(wú)法生長(zhǎng),但在6號(hào)對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)1.56%的條件下,菌株即可導(dǎo)致培養(yǎng)基混濁,因此黃水對(duì)希瓦氏菌的最低抑菌濃度為3.13%。同理,假單胞菌的最低抑菌濃度是1.56%。后文以MIC代表2個(gè)致腐菌的最低抑菌濃度。

表1 黃水對(duì)希瓦氏菌和假單胞菌的MIC

Table 1 Minimum inhibitory concentration of yellow water against Shewanella and Pseudomonas

注：“+”代表渾濁；“-”代表澄清;數(shù)字1～7分別代表50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%的黃水濃度；8代表陽(yáng)性CK,僅加菌液；9代表陰性CK,僅加釀酒黃水

2.3 釀酒黃水對(duì)致腐菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1-a可知,希瓦氏菌CK組8 h進(jìn)入穩(wěn)定期,前8 h的OD均值可達(dá)0.056 OD/h,第8 h OD值為0.47,0.5MIC處理時(shí),前8 h的OD均值僅為 0.028 OD/h,第8 h OD值為0.23,低于CK組正常生長(zhǎng)希瓦氏菌48.9%。相對(duì)而言,當(dāng)希瓦氏菌處于1MIC和2MIC黃水環(huán)境下,生物量不增加,說(shuō)明3.13%的黃水濃度可以有效抑制希瓦氏菌的生長(zhǎng)。

由圖1-b可知,假單胞菌CK組也在8 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期,前8 h的OD均值為0.056 OD/h,第8 h為0.47,然而在0.5MIC黃水處理時(shí),前8 h的OD均值為0.011 OD/h,第8 h為0.09,僅達(dá)到CK組的19.1%,說(shuō)明1.56%的黃水濃度可以有效抑制假單胞菌的生長(zhǎng)。

a-希瓦氏菌；b-假單胞菌

圖1 釀酒黃水對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響

Fig.1 Effect of yellow water on the growth curve

2.4 釀酒黃水對(duì)致腐菌核酸含量的影響

由圖2-a可知,希瓦氏菌CK組的DNA、RNA在8 h熒光強(qiáng)度最高,之后下降,這和圖1-a的生長(zhǎng)曲線相吻合,即生長(zhǎng)曲線在8 h到達(dá)穩(wěn)定期之后開(kāi)始衰減,但是處理組DNA和RNA的熒光強(qiáng)度在6 h達(dá)到頂峰之后迅速衰減,DNA最大值55.3 RFU,僅是CK組最高值的64.9%。此外,處理組的DNA平均熒光強(qiáng)度為42.8 RFU,僅為CK組平均熒光強(qiáng)度的58.8%；RNA平均熒光強(qiáng)度僅為CK組的69.9%。

由圖2-b可知,假單胞菌CK組DNA和RNA熒光強(qiáng)度最高值出現(xiàn)在12 h(分別為97.3 RFU與209.3 RFU)。相比之下,處理組DNA含量在第12 h僅有59.4 RFU,是CK組的61%,處理組的RNA含量在12 h僅有125.1 RFU,是CK組的59.7%。同時(shí),處理組的DNA平均熒光強(qiáng)度為50.7 RFU,僅為CK組的61.5%,RNA平均熒光強(qiáng)度僅為CK組的54.5%。

a-希瓦氏菌；b-假單胞菌

圖2 釀酒黃水對(duì)DNA和RNA含量的影響

Fig.2 Effect of yellow water on synthesis of DNA and RNA

可見(jiàn),黃水對(duì)于希瓦氏菌和假單胞菌的生長(zhǎng)起到了非常明顯的抑制作用,且與菌體剛接觸時(shí)便能夠起效。雷燕等[14]認(rèn)為小分子的有機(jī)酸可以透過(guò)致腐菌的細(xì)胞壁,進(jìn)入其細(xì)胞內(nèi)解離出H+,H+能干擾細(xì)菌DNA和RNA的合成[15-16],從而抑制致腐菌的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)黃水中酸的質(zhì)量濃度可達(dá)19.64 g/L,因此處理組的核酸合成速度驟降可能與黃水中酸類(lèi)物質(zhì)解離出H+影響其合成有關(guān)。

2.5 釀酒黃水對(duì)致腐菌紫外吸收物質(zhì)的影響

由圖3可見(jiàn),在使用Triton×100完全破碎菌體的陽(yáng)性CK組中,希瓦氏菌的蛋白質(zhì)及核酸的量,在0 h分別為1.06 mg/mL、90.7 μg/mL,在5 h分別達(dá)到1.02 mg/mL、92.4 μg/mL；陰性CK組中,希瓦氏菌的蛋白質(zhì)及核酸的量,0 h分別為0.02 mg/mL與4.7 μg/mL,5 h分別為0.04 mg/mL與7.6 μg/mL。值得注意的是,1MIC黃水處理組,0 h時(shí)希瓦氏菌的蛋白含量是陰性CK組的3.33倍,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),5 h時(shí)提高到21.5倍。與此相似,1MIC黃水處理組,0 h時(shí)希瓦氏菌核酸含量為陰性CK的4.57倍,處理時(shí)間延長(zhǎng)至5 h,該數(shù)值增長(zhǎng)到8.19倍?？梢?jiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),1MIC黃水處理組核酸與蛋白釋放量均顯著提高,證明黃水對(duì)于細(xì)胞膜具有破壞性的作用。

a-核酸；b-蛋白質(zhì)

圖3 釀酒黃水對(duì)希瓦氏菌核酸和蛋白質(zhì)含量的影響

Fig.3 Effect of yellow water on the content of Shewanella

注：不同字母表示實(shí)驗(yàn)組間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

同樣,由圖4可見(jiàn),在陽(yáng)性CK組中,假單胞菌的蛋白質(zhì)及核酸的量,在0 h分別為1.21 mg/mL與89.9 μg/mL,5 h時(shí)可達(dá)到1.22 mg/mL與90.9 μg/mL；在不經(jīng)過(guò)黃水和Triton×100處理的陰性CK組中,假單胞菌的蛋白質(zhì)及核酸含量,在0 h分別為0.05 mg/mL、5.61 μg/mL,5 h分別達(dá)到0.05 mg/mL、4.94 μg/mL。值得注意的是,起始階段,處理組與陰性CK組的蛋白質(zhì)釋放量比值為18.8∶1,處理5 h后為24.2∶1；盡管比值提高,但提升幅度并沒(méi)有希瓦氏菌明顯。對(duì)于核酸而言,1MIC處理組與陰性CK組相比,在0 h倍數(shù)差能達(dá)到11.7倍,處理5 h后倍數(shù)差為15.2倍,可見(jiàn)黃水對(duì)于假單胞菌細(xì)胞膜的影響起速快且更為明顯,并且效果穩(wěn)定度較好。

a-核酸；b-蛋白質(zhì)

圖4 釀酒黃水對(duì)假單胞菌核酸和蛋白質(zhì)含量的影響

Fig.4 Effect of yellow water on the content of Pseudomonas

盛杰等[17]研究發(fā)現(xiàn),釀酒黃水會(huì)通過(guò)抑制芽胞桿菌核酸與蛋白的合成,從而達(dá)到抑制其生長(zhǎng)。BAJPAI 等[18]的研究表明,核酸和蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的大分子物質(zhì),正常狀態(tài)下不能透過(guò)細(xì)胞膜,但是當(dāng)菌體細(xì)胞膜通透性增加時(shí),會(huì)從細(xì)胞內(nèi)泄露,因?yàn)樵?60 nm處核酸[19-21]有強(qiáng)吸收,因此可檢測(cè)菌懸液的OD值來(lái)反應(yīng)核酸含量的變化,可得到細(xì)胞膜是否完整的結(jié)果。LONG等[22]的研究也表明,核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子是細(xì)胞的重要組成結(jié)構(gòu),大腸桿菌細(xì)胞膜被破壞時(shí),核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)就會(huì)從細(xì)胞內(nèi)泄露。周倩倩等[23]研究發(fā)現(xiàn),抑菌物質(zhì)丁香酚與希瓦氏菌和假單胞菌接觸后細(xì)胞膜通透性增加,使得核酸和蛋白質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)泄露。這些現(xiàn)象與本研究結(jié)果相符。

2.6 釀酒黃水對(duì)致腐菌細(xì)胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶存在于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜之間,當(dāng)細(xì)胞壁或膜破壞后,堿性磷酸酶會(huì)泄露。如果檢測(cè)到胞外堿性磷酸酶活性上升,就反應(yīng)了該細(xì)胞壁通透性增加。為了進(jìn)一步探究黃水對(duì)于2種魚(yú)類(lèi)致腐菌可能的損傷機(jī)理,測(cè)定了2種致腐菌的AKP活性。由圖5-a可見(jiàn),CK組的希瓦氏菌8 h進(jìn)入穩(wěn)定期之后,由于菌體死亡量增大,AKP的酶活性上升速度加快,0.5MIC處理組與CK組相似。但在1MIC和2MIC處理?xiàng)l件下,2組AKP的酶活力隨時(shí)間延長(zhǎng)上升速度加快,平均可達(dá)8.11及8.59 mmol/(L·h)且加快速度及最終酶活力與黃水濃度呈正比,其中2MIC處理組中,希瓦氏菌的AKP酶活力在12 h內(nèi)由34.4 mmol/L上升了3.9倍,達(dá)到了137.5 mmol/L,顯著高于CK組的100.6 mmol/L(P<0.05)。

由圖5-b可見(jiàn),對(duì)假單胞菌8 h進(jìn)入穩(wěn)定期之后,AKP的酶活力同樣上升速度加快。12 h時(shí),0.5MIC處理組比CK組的酶活力高1.35倍,1MIC處理組比CK組的酶活力高1.53倍,2MIC處理組比CK組的酶活力高1.94倍?？芍罱K的AKP活力與釀酒黃水的濃度呈正比。這些結(jié)果表明細(xì)胞壁的通透性顯著增加,意味著細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性已被破壞。細(xì)胞壁具有固定細(xì)胞形態(tài)、提高細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度、避免滲透壓等外力對(duì)細(xì)胞造成損傷的能力,失去細(xì)胞壁的保護(hù),細(xì)菌很快就會(huì)死亡。因此,釀酒黃水能夠通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁來(lái)提高其抗菌活性。HSOUNA等[24]認(rèn)為酸類(lèi)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁中脂多糖[25]的降解,導(dǎo)致細(xì)胞壁的外膜結(jié)構(gòu)被破壞。經(jīng)檢測(cè)黃水中含有大量有機(jī)酸,因此推測(cè)有機(jī)酸會(huì)作用于2種致腐菌的細(xì)胞壁,導(dǎo)致其破損,從而使胞外AKP活力上升。

a-希瓦氏菌；b-假單胞菌

圖5 釀酒黃水對(duì)AKP活力的影響

Fig.5 Effects of yellow water on AKP activity

2.7 釀酒黃水對(duì)致腐菌形貌的影響

圖6與圖7為黃水處理前后希瓦氏菌和假單胞菌電鏡圖。由圖6-a與圖7-a可見(jiàn),正常的希瓦氏菌和假單胞菌大小為0.2～0.3 μm,桿狀,個(gè)體獨(dú)立,表面光滑、均勻。處理組經(jīng)MIC黃水處理后希瓦氏菌和假單胞菌(圖6-b與圖7-b)表面出現(xiàn)凹凸不平,有的甚至出現(xiàn)凹陷與空洞,說(shuō)明MIC濃度的黃水影響了希瓦氏菌和假單胞菌的細(xì)胞膜完整性,這一現(xiàn)象解釋了AKP酶活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

a-正常形態(tài)菌；b-釀酒黃水1MIC處理

圖6 希瓦氏菌電鏡圖

Fig.6 SEM images of Shewanella

a-正常形態(tài)菌；b-釀酒黃水1MIC處理

圖7 假單胞菌電鏡圖

Fig.7 SEM images of Pseudomonas

HSOUNA等[24]認(rèn)為酸類(lèi)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中脂多糖的降解,破壞細(xì)胞壁中的外膜結(jié)構(gòu)。經(jīng)檢測(cè)黃水中含有豐富的有機(jī)酸,因此2個(gè)致腐菌在黃水的處理下呈現(xiàn)出細(xì)胞壁凹陷的現(xiàn)象很可能與此原因有關(guān)。

3 結(jié)論

3.13%與1.56%的釀酒黃水可以有效抑制希瓦氏菌與假單胞菌的生長(zhǎng)。釀酒黃水破壞希瓦氏菌與假單胞菌的細(xì)胞膜透性與完整性,導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)與核酸泄露,AKP活力上升,影響細(xì)菌正常的代謝過(guò)程,最終使菌體死亡。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),釀酒黃水中所含的乳酸、庚酸、己酸、戊酸、檸檬酸等成分能夠明顯影響希瓦氏菌和假單胞菌生物量的增長(zhǎng),因此推測(cè)酸類(lèi)物質(zhì)為釀酒黃水的有效抑菌成分,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為釀酒黃水用于魚(yú)類(lèi)保鮮做了初步的理論鋪墊。