溫度對產(chǎn)香酵母產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

醬香型白酒是中國傳統(tǒng)白酒的經(jīng)典代表之一,其“三高三長”的釀造工藝形成了醬香型白酒獨特的口感風(fēng)味。其獨特風(fēng)味是由酵母菌、霉菌、細(xì)菌等多種微生物構(gòu)成的發(fā)酵微生物群落在自然環(huán)境和人為調(diào)節(jié)雙重影響下通過天然發(fā)酵形成的[1-3]。酵母菌是醬香型白酒釀造過程中的核心功能菌群,其中生香酵母對酸、醇有不同程度的酯化能力,生產(chǎn)代謝以酯香為主的多種風(fēng)味化合物[4-6],是產(chǎn)生酒體芳香及促進(jìn)酒體豐滿的關(guān)鍵化合物,對醬香型白酒的風(fēng)味感官有著舉足輕重的作用。

長期生產(chǎn)經(jīng)驗及研究表明,溫度是白酒發(fā)酵過程中的重要影響因素之一[7-8]。酵母菌是受溫度影響較大的微生物,目前研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的最適生長溫度一般為28～30 ℃,而醬香型白酒的堆積發(fā)酵溫度為25～50 ℃,堆積過程正是生香酵母大量富集的階段,也是其代謝產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵時期,所以生香酵母會受到堆積發(fā)酵溫度的影響,從而影響其香味物質(zhì)的產(chǎn)生,進(jìn)而影響白酒的口感風(fēng)味。溫度可通過影響酵母菌生長代謝及其一系列生化反應(yīng)過程從而影響酒的產(chǎn)量及質(zhì)量[9-10]。本實驗使用前期從醬香大曲和酒醅中分離篩選得到的6株產(chǎn)香酵母,通過溫度變化,探究溫度對其生長代謝的影響,從而追溯產(chǎn)香酵母的分離篩選環(huán)境,了解其在對應(yīng)生產(chǎn)環(huán)境下生長代謝的變化,以期為白酒機(jī)械智能化釀造提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究所用6株酵母是從這6個酵母種屬中各選出其中1株酵母開展研究(表1),實驗所用產(chǎn)香酵母均由本實驗保藏。

表1 實驗所用產(chǎn)香酵母明細(xì)

Table 1 Details of the aroma-producing yeast used in the experiment

酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(yeast peptone dextrose medium，YPD固體培養(yǎng)基)：在100 mL蒸餾水中加入1 g酵母浸粉、2 g蛋白胨、2 g 葡萄糖、2 g 瓊脂粉，115 ℃滅菌 20 min；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast peptone dextrose medium，YPD 液體培養(yǎng)基)：在100 mL蒸餾水中加入1 g 酵母浸粉、2 g 蛋白胨、2 g 葡萄糖，115 ℃滅菌 20 min。

SW-CJ-LFD超凈工作臺,蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BMJ-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；722S可見光分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司；7890A GC—5975C MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),美國Agilent公司；57348-U萃取頭 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)50/30 μm,美國SUPELCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線測定

1.2.1.1 酵母活化

在YPDA固體培養(yǎng)基上分別挑取6株產(chǎn)香酵母,接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中,于28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h制成種子液。

1.2.1.2 生長曲線測定

設(shè)置不同溫度梯度為25、30、35、40 ℃,將各產(chǎn)香酵母種子液矯正OD680 nm=1.0,以1%的接種量接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中,在25、30、35、40 ℃,4個溫度梯度下進(jìn)行培養(yǎng),設(shè)置3組平行實驗,以滅菌YPD液體培養(yǎng)基為對照。每隔2 h取2 mL菌液于比色皿中,使用可見光分光光度計于680 nm處測定菌懸液的OD680值,然后根據(jù)時間和OD680值繪制不同溫度下各酵母的生長曲線。

1.2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

選取不同溫度下各產(chǎn)香酵母穩(wěn)定中期發(fā)酵液測3組平行,酵母菌發(fā)酵液的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定,香氣物質(zhì)使用配備有 PAL自動進(jìn)樣器的7890A/5975C氣相色譜法質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測,選擇DB-WAX毛細(xì)管色譜柱。將8 mL待測樣品加入20 mL樣品瓶中,同時加入2 g氯化鈉和1 μL內(nèi)標(biāo)(2-辛醇,質(zhì)量濃度 0.822 mg/mL),然后迅速擰緊瓶蓋密封。在45 ℃恒溫條件下,160 r/min平衡10 min。待瓶中的氣-液相香氣物質(zhì)達(dá)到平衡后,將萃取頭插入樣品瓶的頂空部分,攪拌萃取45 min,使樣品瓶中的香氣物質(zhì)達(dá)到氣-固和氣-液平衡。然后將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)樣口,250 ℃熱解吸10 min,采用不分流模式進(jìn)樣。恒流模式,柱流量0.8 mL/min,程序升溫,初始溫度40 ℃,以1 ℃/min 升到45 ℃,保持2 min,以3 ℃/min 升到84 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升到120 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升到200 ℃,以5 ℃/min升到230 ℃,運(yùn)行時間71.667 min,離子源溫度為 230 ℃,電離方式為電子電離(electron ionization,EI),離子能源 70 eV,質(zhì)量掃描范圍為 20～350 u[11-12]。

1.2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

定性分析用GC-MS內(nèi)置比色譜庫NIST14檢索匹配,選取匹配度>80%的物質(zhì),并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證。用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析,將對應(yīng)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行濃度梯度稀釋,外標(biāo)物所在體系與待測樣品在相同條件下平行地處理及檢測運(yùn)用,繪制揮發(fā)性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下6株產(chǎn)香酵母生長狀態(tài)分析

同樣為醬香型酒醅和大曲中篩選得到的6株產(chǎn)香酵母,在不同溫度下生長狀態(tài)各不相同,溫度對其生長發(fā)育影響很大,間接證明溫度對產(chǎn)香酵母生長代謝的影響,影響了醬香型白酒香味物質(zhì)的產(chǎn)生。FBKL2.0161和FBKL2.0130兩株酵母在25和30 ℃下生長發(fā)育正常,在35和40 ℃下不能正常生長,所以圖1-a和圖1-b 35和40 ℃生長曲線重合；FBKL2.00K8,FBKL2.0162和FBKL2.0164三株酵母在25、30、35 ℃下都能正常生長,具有一定的高溫耐受性,在40 ℃下不能生長；酵母FBKL2.0163在25、30、35、40 ℃下都能正常生長,說明該酵母為醬香型白酒中一株耐高溫的產(chǎn)香酵母。

a-FBKL2.0161；b-FBKL2.0130；c-FBKL2.00K8；d-FBKL2.0162；e-FBKL2.0164；f-FBKL2.0163

圖1 不同溫度下6株產(chǎn)香酵母生長狀態(tài)

Fig.1 Growth status of six aroma-producing yeasts at different temperatures

由圖1-a和圖1-b可知,在25、30 ℃下,FBKL 2.0161酵母在8 h進(jìn)入對數(shù)生長期,在24 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期。在這2個溫度下該酵母生長趨勢大致相似。FBKL 2.0130酵母在6 h進(jìn)入對數(shù)生長期,在28 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期。當(dāng)達(dá)到35、40 ℃高溫后,這2株酵母停止生長。由圖1-c～圖1-e可知,這3株酵母在25、30、35 ℃表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài),但當(dāng)?shù)竭_(dá)40 ℃的高溫后,這3株酵母均停止生長。FBKL2.00K8在6 h進(jìn)入對數(shù)生長期,在18 h進(jìn)入穩(wěn)定期,在這3個溫度下生長趨勢大致相似。在25、30 ℃下,FBKL 2.0162酵母在10 h進(jìn)入對數(shù)生長期,在28 h進(jìn)入穩(wěn)定期,在25、30 ℃下生長趨勢大致相同,但在35 ℃下進(jìn)入穩(wěn)定期的時長是25、30 ℃的1倍左右,有研究表明當(dāng)溫度高于一定值后,酵母菌的熱死亡會成為影響比增長速率的因素之一[13],這與該酵母在35 ℃下的生長狀態(tài)表現(xiàn)一致,該酵母可能在35 ℃時發(fā)生細(xì)胞熱死亡。FBKL2.0164酵母的生長速率由快到慢為35、30、25 ℃,由此可知該酵母在35 ℃下生長速率最快,更早到達(dá)穩(wěn)定期,隨著溫度升高,該酵母生長發(fā)育更為旺盛。由圖1-f可知該酵母在4個溫度梯度下生長狀態(tài)良好,在4 h進(jìn)入對數(shù)生長期,進(jìn)入對數(shù)生長期時間短,在8 h左右到達(dá)穩(wěn)定期,生長速率快。該酵母是好氧酵母,在溶氧充足的環(huán)境中,生長迅速,在35～40 ℃條件下,其發(fā)酵效率比釀酒酵母更高[14]。

2.2 相同溫度下6株產(chǎn)香酵母生長狀態(tài)分析

如圖2-a所示,在25 ℃下,6株酵母生長狀態(tài)良好,生長速率為FBKL2.0163>FBKL2.00K8>FBKL2.0130>FBKL2.0161>FBKL2.0162>FBKL 2.0164,FBKL2.0163酵母在25 ℃下生長速率最快,在較短時間內(nèi)獲得高密度,高活力細(xì)胞,適應(yīng)性最強(qiáng),FBKL2.0164酵母在25 ℃下生長速率最慢,進(jìn)入穩(wěn)定期時間最長,在穩(wěn)定期的OD680低于其他菌株,而FBKL2.0130在穩(wěn)定期的OD680高于其他菌株。如圖2-b所示,在30 ℃下,6株酵母生長狀態(tài)良好,生長速率為FBKL2.0163>FBKL2.00K8>FBKL2.0164>FBKL2.0161>FBKL2.0162>FBKL2.0130,FBKL 2.00K8在穩(wěn)定期的OD680高于其他菌株,FBKL2.0164在穩(wěn)定期的OD680最低。如圖2-c所示,在35 ℃下,FBKL2.0130和FBKL2.0161酵母不生長,在發(fā)酵過程中,高溫會使蛋白質(zhì)變性,也會引起質(zhì)膜流動性的變化,如高溫使磷脂分子在膜內(nèi)作快速的側(cè)向擴(kuò)散,使膜脂的流動性增加,破壞膜的完整性,從而導(dǎo)致細(xì)胞的存活力迅速下降,生長速率降低或停止生長[15-16]。在35 ℃下僅4株酵母生長狀態(tài)良好,能適應(yīng)高溫環(huán)境,其生長速率為FBKL2.0163>FBKL2.0164>FBKL2.00K8>FBKL2.0162,FBKL2.0163酵母在35 ℃下生長速率最快,最能適應(yīng)高溫環(huán)境,FBKL2.0162酵母在35 ℃下生長速率最慢,穩(wěn)定期的OD680最低,FBKL2.00K8在穩(wěn)定期的OD680最高。如圖2-d所示,在40 ℃下,僅FBKL2.0163酵母能夠正常生長,能夠適應(yīng)高溫環(huán)境,由此可以看出FBKL2.0163在4個溫度梯度下的生長速率都高于其他5株酵母,對高溫的適應(yīng)性最強(qiáng)。

a-25 ℃；b-30 ℃；c-35 ℃；d-40 ℃

圖2 相同溫度下6株產(chǎn)香酵母生長狀態(tài)對比

Fig.2 Growth status of six aroma-producing yeasts under same temperature

2.3 不同溫度下6株產(chǎn)香酵母揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分變化和熱圖分析

2.3.1 不同種屬酵母菌株代謝產(chǎn)物的差異

由表2～表4和圖3可知,6株不同種屬的酵母菌株的代謝產(chǎn)物有顯著差異,在6株酵母中FBKL 2.00K8酵母產(chǎn)酯能力最強(qiáng),與其他5株酵母產(chǎn)酯量相比有顯著差異,其中酯類物質(zhì)中乙酸乙酯產(chǎn)量最多,有研究表明[17],該類酵母為高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母。乙酸乙酯是白酒中重要的風(fēng)味化合物,是白酒中水果香的主要來源。FBKL2.0130,FBKL2.0161,FBKL 2.0162,FBKL2.0163和BKL2.0164酵母都有較強(qiáng)的產(chǎn)醇能力,主要產(chǎn)生以異戊醇為主的醇類物質(zhì),醇類是白酒的醇甜和助香劑的重要來源,也是酯類的前驅(qū)物質(zhì),它們可以增加酒體的甜度和醇厚感[1]。

圖3 六株產(chǎn)香酵母不同溫度下?lián)]發(fā)性物質(zhì)熱圖

Fig.3 Heat map of volatile substances of six aroma producing yeasts at different temperatures

其中FBKL2.0161的產(chǎn)醇能力最強(qiáng),并且還產(chǎn)生最多的3-羥基-2-丁酮,該物質(zhì)作為合成四甲基吡嗪的重要前體物,可與微生物酶分解原料中蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生的氨發(fā)生非酶促反應(yīng)合成四甲基吡嗪[18]；FBKL2.0130還有最強(qiáng)的產(chǎn)酸能力,其代謝產(chǎn)生以乙酸為主的酸類物質(zhì),其產(chǎn)酸能力與其他5株酵母有顯著差異；FBKL2.0163和FBKL2.0162酵母還產(chǎn)生較多的乙基酯類物質(zhì),包括己酸乙酯(水果)、辛酸乙酯(橙子)、癸酸乙酯(水果)等[19]；FBKL2.0164還產(chǎn)生較多吡嗪類物質(zhì),為酒體提供烘焙、堅果、可可等香氣。

2.3.2 溫度對酵母菌株代謝產(chǎn)物的影響

由表2和圖3可知,溫度對FBKL2.130酵母產(chǎn)酸和產(chǎn)醇的能力有顯著影響,在25 ℃下產(chǎn)酸和產(chǎn)醇含量最高,為30 ℃的2倍和3倍,在25 ℃下產(chǎn)醇顯著較高的是異丁醇,異戊醇,2,3-丁二醇,產(chǎn)酸顯著較高的是乙酸,異丁酸和丁酸。在30 ℃下酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)含量明顯降低。白酒中的高級醇主要通過2個途徑生成：氨基酸降解代謝路徑(Ehrlich代謝機(jī)制)和糖合成代謝路徑(Harris代謝機(jī)制)[20-21]。溫度升高,可能對高級醇代謝路徑上的酶產(chǎn)生影響,從而影響了高級醇的合成。

由表2和圖3可知,FBKL2.00K8在不同溫度下代謝產(chǎn)生大量以乙酸乙酯為主的酯類物質(zhì)為酒體帶來了水果香。有研究表明[17],該類酵母為高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母,與本研究結(jié)果一致。溫度對FBKL 2.00K8酵母的產(chǎn)酯能力有顯著影響,特別是對該酵母產(chǎn)乙酸乙酯的能力影響顯著。在25 ℃下乙酸乙酯的產(chǎn)量是30、35 ℃的2倍。在25 ℃下乙酸乙酯和苯乙醇的產(chǎn)量顯著高于30、35 ℃。醇乙?；D(zhuǎn)移酶是負(fù)責(zé)乙酸乙酯等乙酸酯類合成的關(guān)鍵酶,通過催化乙酰輔酶A和乙醇、異丁醇、異戊醇等醇類生成乙酸酯類物質(zhì)[22-25]。該酵母在25 ℃下產(chǎn)生大量乙酸乙酯,可能是因為在25 ℃下醇乙?；D(zhuǎn)移酶活躍,使該酵母催化產(chǎn)生較多乙酸酯類物質(zhì),隨著溫度的升高,該酵母產(chǎn)酯能力有所下降,可能是高溫使酶變性失活,醇乙?；D(zhuǎn)移酶活性降低,乙酸酯類物質(zhì)含量逐漸減少。

表2 不同溫度下FBKL2.0130和FBKL2.00K8酵母揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分和含量 單位：μg/mL

Table 2 Composition and content of volatile flavor compounds of FBKL2.0130 and FBKL2.00K8 yeast at different temperatures

續(xù)表2

注：同種揮發(fā)性產(chǎn)物肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05;“-”未檢出(下同)

由表3和圖3可知,溫度對FBKL2.0161酵母的產(chǎn)醇和產(chǎn)酮能力有顯著影響,該酵母在25 ℃下產(chǎn)生大量醇類物質(zhì),其含量與30 ℃有顯著差異,在25 ℃下醇類含量有顯著差異的是異丁醇、異戊醇和苯甲醇。該酵母在30 ℃下代謝產(chǎn)生了2,3-丁二醇和3-羥基-2-丁酮2種獨特的物質(zhì)。有研究表明[26],3-羥基-2-丁酮在2,3-丁二醇還原酶作用下生成2,3-丁二醇,在一定條件下3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二醇可相互轉(zhuǎn)化,其在30 ℃下3-羥基-2-丁酮的含量顯著上升。

由表3和圖3可知,溫度對FBKL2.0162酵母產(chǎn)醇和產(chǎn)乙基酯的能力有顯著影響。該酵母在25 ℃下代謝產(chǎn)生以苯乙醇、異戊醇、異丁醇、2-庚醇、2-壬醇、甲基異丁甲醇為主的醇類物質(zhì),其醇類物質(zhì)含量是30、35 ℃的4和14倍。在30、35 ℃則主要代謝產(chǎn)生丁酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯等乙基酯類物質(zhì),其含量與25 ℃有顯著差異。

表3 不同溫度下FBKL2.0161和FBKL2.0162酵母揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分和含量 單位：μg/mL

Table 3 Composition and content of volatile flavor compounds of FBKL2.0161 and FBKL2.0162 yeast at different temperatures

續(xù)表3

由表4和圖3可知,FBKL2.0163酵母在25、30、35、40 ℃下生長狀態(tài)良好,為一株耐高溫產(chǎn)香酵母。在不同溫度下代謝產(chǎn)生大量風(fēng)味物質(zhì),為酒體增加豐富的花香和果香[27]。但溫度對其產(chǎn)醇和產(chǎn)乙基酯的能力有顯著影響。該酵母在25 ℃下代謝產(chǎn)生己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯等具有豐富果香和花香的乙基酯類物質(zhì),并代謝產(chǎn)生異戊醇為主的醇類物質(zhì)。隨著溫度的升高,乙基酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)的產(chǎn)量逐漸降低。

由表4和圖3可知,FBKL2.0164酵母對傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中的風(fēng)味相關(guān)代謝物的產(chǎn)生非常重要[28]。溫度對其產(chǎn)醇能力和產(chǎn)吡嗪能力有顯著影響。其在25 ℃下生產(chǎn)代謝以異戊醇和苯甲醇為主的醇類物質(zhì),隨著溫度的升高,苯甲醇的含量逐漸減少,異戊醇的含量為零。而2,3-丁二醇,2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量明顯增多,在35 ℃時達(dá)到最大值,表明高溫有利于2,3-丁二醇和吡嗪類物質(zhì)的產(chǎn)生。

表4 不同溫度下FBKL2.0163和FBKL2.0164酵母揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分和含量 單位：μg/mL

Table 4 Composition and content of volatile flavor compounds of FBKL2.0163 and FBKL2.0164 yeast at different temperatures

續(xù)表4

3 結(jié)論

本實驗通過對25、30、35、40 ℃溫度梯度下,從醬香大曲和堆積酒醅中分離得到的6株產(chǎn)香酵母的生長代謝進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)在不同溫度下,不同產(chǎn)香酵母的生長能力和發(fā)酵產(chǎn)生香氣的能力有顯著差別。FBKL2.0130和FBKL2.0161酵母適應(yīng)25～30 ℃的常溫發(fā)酵,產(chǎn)酸和產(chǎn)醇能力最強(qiáng)；FBKL2.00K8具有良好的產(chǎn)乙酸酯的能力,能增加白酒的水果香氣；FBKL2.0162和FBKL2.0163能產(chǎn)生較多乙基酯類物質(zhì),賦予白酒樹木果實的香氣。并且FBKL2.0163能在40 ℃的高溫下生長并產(chǎn)生多種揮發(fā)性物質(zhì),FBKL2.0164在35 ℃下產(chǎn)生較多吡嗪類物質(zhì),為白酒提供堅果香氣?？傮w來說,6株生香酵母在25 ℃下都表現(xiàn)出良好的產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的能力,其揮發(fā)性物質(zhì)的含量明顯高于其他溫度梯度,分別為FBKL2.0130(7 090.268 μg/mL)、FBKL2.00K8(2 613.965 μg/mL)、FBKL2.0161(1 289.469 μg/mL)、FBKL2.0162(1 042.398 μg/mL)、FBKL2.0163(1 344.781 μg/mL)和FBKL2.0164(1 367.180 μg/mL)。隨著溫度的升高,每株酵母表現(xiàn)出不同的生長代謝能力。本文探究了溫度對醬香白酒中產(chǎn)香酵母生長代謝的影響,以期為白酒機(jī)械化智能釀造工藝提供一定的理論基礎(chǔ)。