羥基磷灰石-氧化石墨烯復合微球的制備及性能

試劑：磷酸氫二鈉（（NH₃）₂HPO₄）和二水氯化鈣（CaCl₂·2H₂O）購于上海阿拉丁試劑有限公司；碳酸鈉（Na₂CO₃）、檸 檬 酸（C₆H₈O₇）和 無 水 乙 醇（CH₃CH₂OH）購自廣州市東紅化工廠；姜黃素（C₂₁H₂₀O₆，藥用級別，98%）購自上海源葉生物科技有限公司；氧化石墨烯購自湖南豐化材料發(fā)展有限公司；中國倉鼠卵巢細胞株購自江蘇凱基生物技術股份有限公司.

儀器：主要有日本島津傅里葉變換紅外光譜儀、德國Bruker的（D8-ADVANCE）X射線粉末衍射儀、日本電子株式會社公司的JSM-7800&TEAM型場發(fā)射掃描電子顯微鏡、英國雷尼紹公共有限公司的InVia Reflex型激光顯微共聚焦拉曼紅外光譜儀以及Micromeritics公司的全自動比表面積與孔隙度分析儀.

依據(jù)ISO 10993. 1-2018醫(yī)療器械的生物學評估標準對載體材料進行體外細胞毒性測試，采用CCK-8法檢測細胞毒性^[18]．稱取0. 9 g樣品浸泡在無水乙醇24 h，過濾干燥后紫外消毒滅菌．再將樣品浸泡在20 mL的完全培養(yǎng)基中，37℃、CO₂恒溫培養(yǎng)浸提24 h，采用微孔濾膜過濾，收回浸提液．并以此浸提液濃度為基準劃分體積分數(shù)梯度，依次為 1. 0%、 5. 0%、 10. 0%、 20. 0%、 50. 0%、70. 0%、80. 0%和100. 0%的浸提液和完全培養(yǎng)基9個梯度，以完全培養(yǎng)基作為對照組，其余作為實驗組．將中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞接種于96孔板，每組10孔．各組分別加入200 μL對照培養(yǎng)液或不同濃度的浸提液．培養(yǎng)72 h后，在每孔加入CCK-8試劑，輕微震蕩后繼續(xù)放入恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 h后用實時酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔在450 nm波長處的光密度值D（4 5 0），實驗重復測5次，取平均值，計算得出細胞相對增殖率.

配制一系列姜黃素無水乙醇溶液測定吸光度，計算回歸方程，建立標準曲線.

分別稱取4種CaCO₃-GO模型生成的HA-GO樣品各50 mg，將它們置于姜黃素的乙醇溶液中勻速混合24 h．在8 000 r/min下離心15 min，分離并收集上清液，重復加入無水乙醇離心，使收集到的上清液總量為20 mL．測量上清混合液的光密度，通過與之前姜黃素乙醇溶液的標準曲線對比，計算微球的載藥量和包封率，并設置3個平行實驗以減少誤差．同時取空白樣，置于無水乙醇中同樣操作，排除空白微球的浸出物對測試過程的影響．包封率和載藥量的計算公式為

按2015版中國藥典的規(guī)定對載藥微球進行體外釋放試驗^[19]，釋放溶液使用體積分數(shù)為20%的乙醇稀鹽酸溶液來模擬人工胃液（pH=1. 5）. 稱取50 mg載藥樣品，放入透析袋中，然后放入釋放溶液中，在37℃水浴條件下攪拌，進行藥物緩釋實驗．分別于0. 5、1、2、4、8、12、24、48、72和96 h時取出4 mL釋放溶液，同時補充4 mL模擬的人工胃液，測量各個時間點釋放溶液的在波長為（427 ± 1）nm處吸光度，同樣進行3個平行樣測試，減小誤差．緩沖液中藥物的累積釋放率E為其中， V₀為緩沖溶液的總體積（單位： mL）； V為每次取出緩沖溶液的體積（單位： m L ）； ρ_n為第n次吸取緩沖溶液時測定的藥物質量濃度（單位：mg/mL）；ρ_i為第i次置換取樣時測定的藥物溶液質量濃度（單位：mg/mL）；m (藥物)為載藥微球中包裹的藥物質量（單位：mg） .

圖1為不同反應濃度條件下制備的CaCO₃-GO的XRD圖譜．碳酸鈣主要有文石、方解石和球霰石3種無水結晶相．方解石是熱力學最穩(wěn)定，能量最低的晶型，而球霰石是熱力學最不穩(wěn)定．能量最高，文石介于兩者之間^[20]．低反應濃度（c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）=0. 1 mol/L）與高反應濃度（c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）=1. 0 mol/L）得到的XRD圖譜顯示均為方解石晶型，根據(jù)比對方解石的標準卡片（PDF#05-0586），圖譜的強衍射峰基本與方解石的（104）、（018）和（116）等晶面符合，進而可以判斷合成的為方解石的碳酸鈣．對比球霰石的標準卡片（PDF#33-0268），在0. 3 mol/L反應條件下，出現(xiàn)球霰石的衍射峰，其（112）和（114）晶面衍射峰強度很高，不過仍然顯示存在方解石的衍射峰．在0. 5 mol/L時，也可以明顯看出兩種晶型的衍射峰同時存在，但方解石的衍射峰強度強一些．說明在低反應濃度時生成的主要是熱力學較穩(wěn)定的方解石晶型的CaCO₃，在增大反應濃度后，部分方解石晶型向球霰石晶型轉化，但濃度增大到一定程度時，存在形式又轉化為穩(wěn)定的方解石．說明反應濃度確實影響碳酸鈣的晶型變化，在適當?shù)姆磻獫舛认驴梢陨汕蝣笔停瓽O的特征衍射峰在2θ=11. 7°處，可能由于本實驗中強度太弱，沒有檢測到．

圖1 不同反應濃度制備的CaCO3-GO的XRD圖譜Fig. 1 The XRD patterns of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.

圖2為不同反應濃度度條件下制備的CaCO₃-GO的FTIR圖譜．由圖2可見，c（CaCl₂）=c（Na₂CO₃）分別為0. 1 mol/L和1. 0 mol/L制備的樣品中在712 cm^-1處有明顯吸收峰，屬于方解石的CO₃^2-基團的O—C—O面內(nèi)變形振動峰．而0. 5 mol/L樣品在745 cm^-1處出現(xiàn)吸收峰，這屬于球霰石的CO₃^2-基團的O—C—O面內(nèi)變形振動峰，同時也在712 cm^-1有明顯吸收峰，說明方解石與球霰石2種晶型共存．當反應濃度為0. 3 mol/L時，712 cm^-1處的吸收峰較弱，不太明顯；745 cm^-1處的球霰石吸收峰比較明顯而且清晰，說明此樣品主要是球霰石型的CaCO₃，這也與上述XRD分析結果一致.

圖2 不同反應濃度制備的CaCO3-GO的FTIR圖譜Fig. 2 FTIR images of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.

圖3為不同反應濃度制備的CaCO₃-GO的FESEM圖像．從圖3可明顯看出，低反應濃度時合成的是棒狀顆粒，長度為1. 0～2. 5 μm，直徑在100～200 nm，呈束狀聚集（如0. 1 mol/L時）；當反應濃度增大到0. 3 mol/L時，出現(xiàn)球狀顆粒，且表面光滑，球狀比較完整，部分呈橢球狀，夾雜少許棒狀顆粒，球形的粒徑為0. 9～2. 0 μm，粒徑分布比較均勻；當濃度增至0. 5 mol/L時，球狀減少，多呈圓餅狀且大小不一，同時還有不太規(guī)則的棒狀存在；當高反應濃度1. 0 mol/L時，基本上沒有微米級的可辨識形貌，只有納米顆粒呈團聚分布．從圖3可明顯看出，反應濃度對碳酸鈣是否能呈現(xiàn)微球狀的形貌有重要的影響.

圖3 （a）0. 1CaCO3-GO、（b）0. 3CaCO3-GO、（c）0. 5CaCO3-GO和（d）1. 0CaCO3-GO的FESEM圖像Fig. 3 FESEM images of (a) 0. 1CaCO3-GO, (b) 0. 3CaCO3-GO, (c) 0. 5CaCO3-GO, and (d) 1. 0CaCO3-GO.

圖4為4種不同初始反應濃度制備的CaCO₃-GO水熱后生成的HA-GO的XRD圖譜．總體來看，碳酸鈣的衍射峰基本消失．與HA的標準卡片（PDF# 09-0432）對比可以看出，不同反應濃度下生成的HA-GO復合物均出現(xiàn)HA的特征衍射峰^[21-22]．說明CaCO₃轉化成了HA，且純度也比較高．同時，在2θ≈11°時有很微弱的峰，此處為HA與GO重疊的衍射峰.

圖4 不同初始反應濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO的XRD圖譜Fig. 4 XRD patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.

圖5為不同初始反應濃度制備的CaCO₃-GO水熱后生成的HA-GO的傅里葉紅外圖譜．由圖5可見，在569和605 cm^-1處為PO₄^3-基團的彎曲振動峰， 1 050 cm^-1處的吸收峰為PO₄^3-基團的伸縮振動吸收峰^[23]．同時還發(fā)現(xiàn)，712 cm^-1處的球霰石的CO₃^2-基團振動峰已消失，745 cm^-1處方解石的特征吸收峰也不再出現(xiàn)．1 462 cm^-1和415 cm^-1處為GO的C—O振動峰，也為CO₃^2-基團的C—O振動峰，可能是由于水熱反應后仍有部分CO₃^2-存在于HA中．3 500 cm^-1處的吸收峰應該是GO的—OH峰．結合上述XRD分析，碳酸鈣已基本轉化為HA，說明該水熱反應條件下陰離子交換比較徹底.

圖5 不同初始反應濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO的傅里葉紅外圖譜Fig. 5 FTIR patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.

圖6為不同反應濃度下制備的HA-GO的SEM圖．在圖6（a）中，0. 1CaCO₃-GO經(jīng)過水熱反應后得到0. 1HA-GO粉末，雖然其基本形態(tài)還呈棒狀，不過已轉化為HA顆粒，呈散亂分布；圖6（b）為0. 3HA-GO，從形貌上看基本成球狀，從部分破碎的微球可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)部呈中空結構，微球表面十分粗糙，大小比較均一；圖6（c）為0. 5HA-GO，可以看到部分微球綴連在GO的邊緣；從圖6（d）的高倍電鏡下可以看到，微球表面有明顯的顆粒存在，這是轉化后的納米HA生成在表面；而圖6（e）中的1. 0HA-GO已經(jīng)團聚成塊狀了．

圖7是在180℃進行CaCO₃-GO水熱反應，反應時間分別為3、6和12 h生成的HA-GO的XRD圖譜．由圖7可見，當反應時間為3h時，對比標準卡片已經(jīng)出現(xiàn)HA的晶相，而球霰石的特征衍射峰仍然存在，說明兩者共同存在，此時CaCO₃已經(jīng)開始轉化為HA．經(jīng)過高溫高壓，PO₄^3-開始跟CaCO₃中的CO₃^2-進行交換^[24]，但仍有CaCO₃的衍射峰，說明部分CaCO₃沒有轉化成功．而隨著時間的延長，交換越來越徹底，在反應6 h和12 h時，已經(jīng)沒有CaCO₃的衍射峰，說明CaCO₃已完全轉化為HA.

圖6 （a）0. 1HA-GO、（b）0. 3HA-GO、（c）0. 5HA-GO、（d）16 000倍鏡下的0. 3HA-GO和（e）22 500倍鏡下的1. 0 HA-GO的SEM圖Fig. 6 SEM images of (a) 0. 1HA-GO, (b) 0. 3HA-GO, (c) 0. 5HA-GO, (d) high magnification of 0. 3HA-GO, and (e) 1. 0 HA-GO.

圖7 不同水熱時間制備的HA-GO的XRD圖譜Fig. 7 XRD patterns of HA-GO prepared at different hydrothermal times.

圖8為不同水熱反應時間（3、6和12 h）條件下制備的HA-GO的SEM圖像．由圖8可以看出，樣品基本都呈球狀，并保持模板CaCO₃的形態(tài)．水熱反應時間3h的樣品，微球表面粗糙，且有微小的顆粒存在．反應時間為6h時，微球更加粗糙，表面顆粒變大．增加水熱時間至12 h，有的微球破碎，表面粗糙，內(nèi)部呈現(xiàn)中空結構，有網(wǎng)絡狀微結構存在．結合XRD分析，可以看出水熱反應時間為6 h時能獲得形貌較好、轉化徹底的HA-GO微球．

圖8 水熱時間分別為（a）3 h、（b）6 h和（c）12 h制備的HA-GO的SEM圖Fig. 8 SEM images of HA-GO prepared with hydrothermal time of (a) 3 h, (b) 6 h, and (c) 12 h.

因此，以下實驗將使用0. 3HA-GO且水熱反應時間為6 h、形貌較好的復合微球進行相關測試分析.

圖9為HA-GO復合微球的拉曼光譜．從圖9可見，在1 350 cm^-1處，GO和0. 3HA-GO都有1個明顯的振動峰，稱為D帶，這是石墨烯的無序振動峰．位于1 600 cm^-1的峰屬于石墨烯的本征拉曼模式，稱為G帶．589和960 cm^-1分別對應于v3 （PO₄^3-）反對稱變角振動峰及v1（PO₄^3-）對稱伸縮振動峰，是HA的特征峰．用D帶與G帶的強度比（I_D/ I_G）表征石墨烯材料的無序度．GO的I_D/ I_G=0. 85，HA-GO的I_D/I_G=0. 94，復合樣品擁有較高的I_D/I_G，表明復合樣品中GO的缺陷密度增加.

圖 10是0. 3HA-GO微球的Barrett-Joyner-Halenda （BJH）孔徑分布圖以及吸脫附等溫曲線．根據(jù)吸脫附等溫曲線可知，微球的吸脫附等溫曲線符合典型的Ⅲ型等溫線，其滯后環(huán)為H3型^[25]，說明微球的組成微粒之間存在許多狹縫型的孔隙，觀察相應SEM圖也可相互印證這點．測得比表面積為22. 71 m²/g．根據(jù)孔徑大小分類：孔徑≤2 nm為微孔；孔徑介于2～50 nm的為介孔；孔徑≥50 nm為大孔．通過BJH法分析微球孔徑可知，微球的平均孔徑為30～50 nm，屬于介孔材料．結合以上分析可知，制備的HA-GO復合微球是內(nèi)部中空結構的介孔材料．

圖9 GO和0.3HA-GO復合微球的拉曼光譜Fig. 9 Raman spectra of GO and 0. 3HA-GO composite microspheres.

圖 10 HA-GO微球的BJH孔徑分布圖及吸脫附等溫曲線（a）BJH孔徑分布；（b）吸脫附等溫曲線Fig.10 Adsorption-desorption isotherm curve of HA-GO microspheres. (a) BJH pore size distribution map, (b) adsorption and desorption isotherms.

通過體外培養(yǎng)CHO細胞評估HA-GO復合微球對細胞增殖的影響，結果如圖 11．CCK-8的結果表明，以對照組統(tǒng)計學數(shù)量為參考標準，不同濃度的浸提液對細胞增殖基本沒有負面影響，說明含復合微球物質的培養(yǎng)液沒有毒性，因而復合微球對細胞增殖基本上沒有毒性．

圖 11 不同體積分數(shù)的微球浸提液培養(yǎng)下的細胞相對增殖率Fig. 11 Relative proliferation rates in culture extracts of different amounts of the microspheres.

通過紫外分光光度計測定得到姜黃素在無水乙醇中的最佳吸收波長為（427 ± 1）nm．同時，在（427 ± 1）nm波長處測定配置的一系列姜黃素乙醇溶液的吸光度，繪制標準曲線如圖 12．通過線性擬合，發(fā)現(xiàn)在姜黃素乙醇溶液質量濃度為0. 05～2. 0 μg/mL內(nèi)呈良好線性關系.

圖 12 姜黃素在無水乙醇中的標準曲線Fig. 12 Standard curve of curcumin in absolute ethanol. Black square is the experimental data，and red line is the fitting curve.

包封率和載藥量是衡量載藥微球載藥性能的重要指標，載藥量和包封率高可使微球材料得到充分利用，從而減少原材料的浪費和給藥次數(shù)，減輕患者頻繁給藥的痛苦，臨床應用價值更高．圖 13為復合微球的包封率及載藥量，由圖 13可見， 0. 3HA-GO的樣品擁有較好的負載能力，其載藥量達到（2. 95 ± 0. 19）% ，包封率達到（20. 90 ± 0. 31）%．這主要是因為0. 3HA-GO形成的是表面粗糙內(nèi)部中空的微球，給藥物提供了更多的著位點，利于藥物吸附．

圖 13 HA-GO的包封率與載藥量的柱狀圖Fig. 13 Histograms of drug encapsulation efficiency (black) and drug loading (red) of HA-GO.

由于姜黃素屬于醇溶性物質，因此使用體積分數(shù)為20%的乙醇稀鹽酸溶液（pH=1. 5）作為模擬人工胃液進行體外釋藥測試（圖 14）．由圖 14可以看出，載藥復合微球初釋放時呈平穩(wěn)釋放，沒有明顯的突釋現(xiàn)象，在給藥后120 h時的累計釋放率達到72%．由曲線的走勢來看，釋放率還在緩慢抬升，說明藥物后期還會釋放，最終藥物累積釋放率將高于72%，說明HA-GO微球既能起到緩釋，又能基本將藥物完全釋放.

圖 14 載藥微球在體積分數(shù)為20%乙醇的模擬人工胃液（pH=1. 4）中的累積釋放率隨時間變化Fig. 14 Cumulative release rate of drug-loaded microspheres in artificial gastric juice (pH=1. 4) supplemented with volume fraction of 20% ethanol changes with time.