谷物源抗氧化肽：制備、構效及應用

生物活性肽是由天然氨基酸以不同排列方式(線性、環(huán)形)構成的二肽及多肽的總稱，分子質(zhì)量一般<6 000 Da，含有3～20個氨基酸殘基。除提供能量和必需氨基酸外，還具有多種生物活性，如抗氧化、降壓、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛等[1]?？寡趸?antioxidant peptides, AOPs)是一類重要的生物活性肽，由5～16個氨基酸殘基組成[2]，其抗氧化作用主要表現(xiàn)在：直接猝滅自由基，如超氧陰離子羥自由基(·OH)、烷過氧基(ROO·)、烷氧基(RO·)和過氧化氫分子(H2O2)等；調(diào)節(jié)內(nèi)源性氧化還原酶活性；保護細胞膜脂質(zhì)。作為天然抗氧化劑，抗氧化肽比化學抗氧化劑例如丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、特丁基對苯二酚( tert-butylhydroquinone，TBHQ)等具有更高的生物安全性，在功能食品、生物醫(yī)藥等行業(yè)具有廣闊的應用前景[3]。用于制備抗氧化肽的食物蛋白原料非常豐富，主要來源于海產(chǎn)品、藻類、畜禽產(chǎn)品、蛋奶、谷物等。目前抗氧化肽的研究多集中于海洋生物來源的抗氧化肽，但植物源抗氧化肽的來源更具多樣性[4]。

全球范圍內(nèi)，谷物作為人類主食及牲畜飼料，約占人類能源需求的一半以上。谷物原料產(chǎn)量高，氨基酸含量豐富，且谷物蛋白價格低廉、安全性高，可作為抗氧化活性肽的主要來源。如米糠蛋白中的酸性氨基酸、堿性氨基酸及疏水性氨基酸，玉米蛋白中的疏水性氨基酸(亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸)，均是抗氧化肽的良好來源[5]。因此，低價、安全的谷物源抗氧化肽的開發(fā)已成為研究熱點。

本文綜述了谷物源抗氧化肽的制備方法、構效關系及其在食品、日化等領域的應用，以期為開發(fā)谷物源抗氧化功能產(chǎn)品提供參考。

1 谷物源抗氧化肽的來源與制備

1.1 谷物源抗氧化肽的來源

根據(jù)原料來源不同，谷物源抗氧化肽可以分為大米抗氧化肽、玉米抗氧化肽、大豆抗氧化肽、燕麥抗氧化肽、黑豆抗氧化肽等。豆類中含有相對較高的蛋白質(zhì)，因此，從豆類中鑒定出的抗氧化肽比從其他谷物中鑒定出的抗氧化肽更多；玉米蛋白中含有豐富的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸等疏水性氨基酸以及脯氨酸和谷氨酸，被認為是抗氧化肽的良好蛋白來源；大米米糠蛋白含有豐富的賴氨酸、丙氨酸、谷氨酸和絲氨酸，也常用于抗氧化肽制備；小麥麥胚蛋白中含有豐富的具有抗氧化活性的氨基酸序列。由谷物蛋白獲得的抗氧化活性肽被認為是安全抗氧化劑的天然來源，相對其他蛋白來源(如畜禽、海洋生物)，谷物蛋白具有來源廣泛、成本低的特點。

1.2 谷物源抗氧化肽的制備

生物活性肽的制備有兩種方式(圖1)，一種是通過傳統(tǒng)的方法(包括酶解法、微生物發(fā)酵法)將原料蛋白中的生物活性肽釋放出來，然后通過分離純化獲得具有某種特定活性的肽段；另一種是通過計算機輔助模擬水解，借助生物信息學工具(數(shù)據(jù)庫)篩選合適蛋白酶類型，通過合成驗證活性獲得生物活性肽。目前涉及到抗氧化肽的數(shù)據(jù)庫僅有BIOPEP，且僅有少數(shù)序列，因而采用計算機輔助模擬水解制備抗氧化肽的方法受到限制[6]。

圖1 傳統(tǒng)抗氧化肽制備技術路線與計算機模擬制備 抗氧化肽技術路線的比較[7]
Fig.1 Comparison of traditional antioxidant peptides preparation technology route and computer simulation of enzymatic hydrolysis to prepare antioxidant peptides[7]

1.2.1 酶水解法

抗氧化肽在母體蛋白結構中以無活性肽段存在，需要通過酶解才能釋放其活性。酶水解法是制備抗氧化肽最常用的方法，該方法具有以下特點：(1)條件溫和，易控制；(2)蛋白酶水解具有選擇性，產(chǎn)生副產(chǎn)物少；(3)安全性高，無有毒化學物質(zhì)殘留。

制備抗氧化肽的蛋白酶至關重要，不同的蛋白酶可以釋放出不同分子質(zhì)量及氨基酸序列的肽。蛋白酶主要有胃腸道消化酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶等。微生物蛋白酶因具有較高酶活性和較低價格，被認為是較理想的工業(yè)用酶源。根據(jù)水解環(huán)境不同，蛋白酶還可分為酸性、中性和堿性蛋白酶。堿性蛋白酶對疏水性氨基酸有較強的專一性，因此常采用堿性蛋白酶制備抗氧化肽(表1)。研究發(fā)現(xiàn)玉米蛋白粉的堿性蛋白酶水解產(chǎn)物具有體外清除自由基的活性及Caco-2細胞的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)清除活性[8]。高粱蛋白水解可以產(chǎn)生具有高抗氧化活性的活性肽段，這主要是因為堿性蛋白酶能夠水解Glu、Met、Leu、Tyr、Lys及Gln的羧基端，使其釋放出更多具有抗氧化活性的產(chǎn)物[9]。中性蛋白酶則在大米及米糠蛋白水解中應用較多。反應溫度、pH、底物濃度、酶濃度及水解條件等都會影響酶解效率，進而影響水解產(chǎn)物的抗氧化活性。由于酶具有專一性且酶切位點有限，通常需要選擇適當?shù)膹秃厦高M行酶解。利用堿性蛋白酶和風味蛋白酶共同水解玉米蛋白，結果發(fā)現(xiàn)兩種蛋白酶共同酶解的效果比單一蛋白酶好，表現(xiàn)出更高的抗氧化活性[10]。

目前，酶水解法為制備抗氧化肽的最常用方法，但該方法仍存在收率低，工業(yè)化生產(chǎn)成本較高的問題。因此，近年來研究者們開始將一些新興加工技術例如微波、高壓、脈沖電場等與酶水解方法結合，以克服傳統(tǒng)方法的局限性。研究發(fā)現(xiàn)，微波加熱可以促進酶水解，減少水解時間，提高水解產(chǎn)物品質(zhì)[11]。高壓聯(lián)合酶水解處理可以影響花生蛋白的酶水解和部分蛋白質(zhì)結構特性，提高花生蛋白水解物的抗氧化活性[12]。脈沖電場輔助酶水解可以提高谷物源抗氧化肽的抗氧化活性，LIN等[13]實驗發(fā)現(xiàn)在電場強度為5 kV/cm、脈沖頻率為2 400 Hz、保留時間為2 h的條件下，大豆源肽段Ser-His-Cys-Met-Asn的DPPH自由基抑制率達到(94.35±0.03)%。有研究證實，通過超聲波輔助酶解制備玉米抗氧化劑水解物，在最佳超聲預處理下，DPPH自由基和·OH清除能力顯著提高[14]。

表1 谷物源抗氧化肽的來源及氨基酸序列
Table 1 Origin and amino acid sequence of antioxidant peptides from cereals

1.2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是通過微生物代謝過程中產(chǎn)生的復合酶系，將底物蛋白酶解進而釋放出具有活性肽類物質(zhì)的方法。發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)來源、菌種選擇、發(fā)酵溫度和時間、pH等條件都會影響酶解程度。目前，可用于制備抗氧化肽的微生物主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、曲霉菌及乳酸菌等[24]。利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備的米糠活性肽包含6種人體必需氨基酸，具有較強的清除DPPH自由基能力[25]。利用巴氏乳桿菌Fn032發(fā)酵小米獲得的抗氧化肽SGYYMH、LGTFQN、LHALLL，具有較強的清除DPPH自由基能力[26]。

微生物發(fā)酵法具有以下優(yōu)點：利用微生物發(fā)酵法所生產(chǎn)的抗氧化肽能夠直接進入消化系統(tǒng)，易被人體吸收利用，安全性高；微生物具有來源廣泛、價格低廉的特點；相比蛋白酶水解法，微生物發(fā)酵代謝過程中產(chǎn)生的肽酶可以減少苦味物質(zhì)。目前存在的問題：微生物發(fā)酵法生產(chǎn)技術不完善；可用于抗氧化肽的無毒無害產(chǎn)酶菌種受限；發(fā)酵法產(chǎn)生復合酶體系的作用機理尚未闡明等。

1.2.3 其他方法

除上述兩種方法外，用于制備抗氧化肽的方法還有化學水解法、化學合成法、分離提取法、基因工程法及物理提取法等?；瘜W水解法是指加入化學試劑使蛋白質(zhì)水解得到水解產(chǎn)物的方法，包括酸水解和堿水解，這種方法具有成本低、操作簡單和應用方便等特點，但缺乏靈敏度和特異性，且易造成肽失活、殘留有害物質(zhì)和污染環(huán)境。例如傳統(tǒng)的酸水解通常是基于高溫條件下在過酸溶液中處理樣品，處理過程中易破壞一些必需氨基酸，如色氨酸、蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸[27]?；瘜W合成法是按照已知的氨基酸序列定向形成目標肽鍵，具有操作簡便、產(chǎn)率高、可定向合成目的多肽等特點，但由于其合成過程中使用的部分溶劑如N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)、二氯甲烷(dichloromethane，DCM)等具有較大的毒性，殘留物可能對人體產(chǎn)生有害影響，在實際應用中受到了限制。分離提取法指直接從動植物體內(nèi)分離純化抗氧化肽，具有成本高、操作難度大、產(chǎn)量低等缺點，更適用于特定藥物的生產(chǎn)和開發(fā)?；蚬こ谭ㄊ抢肈NA重組技術，通過合適的DNA模板來控制抗氧化肽的序列合成，具有安全性高、成本低、原料來源廣等特點，但由于表達效率低、產(chǎn)品提取及回收難度大，導致其在短鏈肽合成方面存在較大弊端[28]。物理提取法是通過超高壓連續(xù)流細胞破碎儀來制備多肽，可以破壞動植物組織的細胞壁、細胞膜，最大程度的保護多肽的生物活性。該方法是近幾年提出的新概念，技術不夠成熟，對儀器要求高、得率低。

2 谷物源抗氧化肽構效關系

2.1 影響抗氧化肽構效關系的主要因素

抗氧化肽的活性除受蛋白來源、蛋白酶、水解度、水解條件等影響外，還與氨基酸組成、氨基酸序列、肽段分子質(zhì)量大小、肽構象等因素有關。其中，多肽序列中的氨基酸殘基被認為是影響多肽抗氧化活性的最重要因素。深入研究抗氧化肽的構效關系，可以在生產(chǎn)中通過控制底物的水解度來調(diào)節(jié)抗氧化肽的產(chǎn)率和活性，從而提高生產(chǎn)效率和降低成本。

2.1.1 氨基酸組成

氨基酸組成是影響抗氧化肽活性的重要因素。一些活性較高的抗氧化肽中His、Cys、Pro、Trp、Arg含量較高，且肽的N端氨基酸多為疏水性氨基酸。疏水氨基酸殘基有利于肽和脂質(zhì)中自由基的相互作用，從而有助于清除脂相產(chǎn)生的自由基[29]。研究證實，細胞抗氧化活性與肽的N端或C端存在Tyr、Trp殘基有關，Tyr的酚羥基、Trp的吲哚基、Cys的巰基及His的咪唑基等可以作為氫的電子供體捕獲自由基，達到清除自由基的作用[30]。疏水性氨基酸如Leu、Val、Ala、Phe及Pro等可以用作芳香殘基側鏈上自由基過氧化的供氫體，提高肽的抗氧化性[31]。此外，含硫氨基酸中Met上的S原子及Cys的巰基使其具有清除自由基的能力，可以減少亞油酸氫過氧化物的生成[32]。

有研究表明，含有His的肽具有較高抗氧化活性，這可能與位于His側鏈上的咪唑基團具有猝滅自由基、螯合金屬離子及抑制脂質(zhì)過氧化作用有關[33]。大米肽FRDEHKK和DHHQ主要是通過螯合作用抑制亞油酸的過氧化作用，這兩種肽中均含有His和Asp，說明這兩種氨基酸有助于其抗氧化活性提升[34]。研究發(fā)現(xiàn)，Val可能有助于多肽與膜脂雙層的相互作用，促進其進入細胞，從而起到提高抗氧化活性的作用；也可能是通過促進抗氧化肽與脂溶性自由基的相互作用，減弱脂質(zhì)過氧化，進而提高抗氧化活性[35]。許多學者還發(fā)現(xiàn)，在一些蛋白水解產(chǎn)物中分離鑒定的抗氧化肽含有豐富的Gly和Pro，這兩個氨基酸對于抑制亞油酸過氧化有一定的貢獻，且具有一定的自由基清除能力[36]。

2.1.2 氨基酸序列

研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化肽中相同的氨基酸殘基處于肽段不同位置時會影響其抗氧化活性。NAOHIKO等[37]研究了不同二肽對亞油酸抗氧化活性的影響，結果表明Ala、Tyr和Trp位于N端時二肽的抗氧化能力更強。含有His殘基N端的肽比含有His殘基C端的肽具有更高的螯合能力和自由基清除能力,若將Pro-His-His中C端的His殘基替換成其他氨基酸殘基，活性沒有顯著性變化；但若將中間的His殘基替換成Trp，活性大大下降，這說明肽段Pro-His-His中間的His殘基對其抗氧化活性非常重要，而C端的His殘基則沒有那么重要[38]。Leu殘基位于玉米抗氧化肽N端時，可以增強抗氧化肽與脂肪酸的相互作用，提高其對脂質(zhì)自由基的捕捉能力，從而提高抗氧化活性[39]。氨基酸殘基之間存在協(xié)同和拮抗作用，并非簡單將抗氧化活性高的氨基酸殘基組合就可得到抗氧化活性高的肽段，因此對于氨基酸序列與抗氧化作用之間的關系值得持續(xù)關注。

2.1.3 肽段分子質(zhì)量

研究證實，肽段分子質(zhì)量大小會影響其抗氧化活性，低分子質(zhì)量肽段具有更高的抗氧化活性，2～10個氨基酸殘基的短肽要比10～50個氨基酸殘基的多肽抗氧化活性高。相比分子質(zhì)量大的肽段，分子質(zhì)量小的肽段更能有效地通過生物膜，靶向清除脂質(zhì)自由基，表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。HERNNDEZ-LEDESMA等[7]利用抗氧化肽WYSLAMAASDI設計合成了WY、WYS、WYSL、WYSLA、WYSLAM及WYSLAMA這6條肽段，通過抗氧化活性測定發(fā)現(xiàn)WY的氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)活性最強，推測可能與肽段分子質(zhì)量大小有關。SHEN等[40]研究發(fā)現(xiàn)肽段LGFEY和LGFYY的抗氧化活性是由于Phe及Tyr的存在，在C端添加一個Tyr殘基，ORAC活性有所下降，說明分子質(zhì)量大小會影響肽段的抗氧化活性。

2.1.4 肽的構象

肽的構象是指肽二級及以上的空間結構，其也會影響肽的抗氧化活性。LIANG等[41]研究發(fā)現(xiàn)細胞抗氧化活性與肽構象，特別是α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量呈負相關。通過比較玉米面筋蛋白中的AGLPM、AGIPM、HALGA和HIGA四種多肽，發(fā)現(xiàn)亮氨酸多肽AGLPM和HALGA在HepG2氧化應激反應中顯示出更強的保護作用，表明細胞抗氧化活性與肽的二級結構相關；此外，還發(fā)現(xiàn)AGLPM、HALGA清除自由基能力高于AGIPM、HAIGA，表明Leu因具有較低的α-螺旋及無規(guī)則卷曲含量，而使得其比Ile的抗氧化活性更大，說明肽的抗氧化活性會受到氨基酸相互作用及構象的影響[42]。

2.2 定量構效關系

定量構效關系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)模型是一種通過建模研究結構與活性之間關系的數(shù)學表達方法。QSAR研究最早出現(xiàn)在藥物、農(nóng)學、有機化學等領域，現(xiàn)已成功用于抗菌劑、ACE抑制劑和苦味肽的研究中。近年來，QSAR模型在研究肽的生物活性和構效關系方面取得了很大的進步。LI等[43]使用QSAR模型，通過完全交叉驗證和外部驗證發(fā)現(xiàn)，氨基酸C末端和N末端的理化性質(zhì)與抗氧化活性之間存在一定的關系；在預測抗氧化活性時，C末端氨基酸的性質(zhì)比N末端氨基酸更重要。

抗氧化肽的QSAR研究關鍵步驟為：數(shù)據(jù)準備、數(shù)據(jù)分析和模型驗證(圖2)。其中結構定量表征是QSAR研究的關鍵環(huán)節(jié)，包括物理化學、分子拓撲和理論計算等參數(shù)。由于多肽結構具有多樣性、構效關系復雜性，需要借助一些分析方法使得數(shù)據(jù)更為可靠，其中偏最小二乘(partial least-square method，PLS)和支持向量機(support vector machine，SVM)分別是用于建立線性和非線性模型最常用的回歸方法，多元線性回歸法可以為抗氧化活性與結構之間的機理闡述提供方便[44]。

圖2 多肽的QSAR模型研究過程
Fig.2 Study on the process of polypeptides in QSAR model

通過建立QSAR模型，可以評估谷物蛋白作為抗氧化肽的潛在前體，預測蛋白質(zhì)在不同蛋白酶的水解下可能釋放的抗氧化活性肽，還可以定向合成高抗氧化活性的肽類。QSAR模型可以從理論上推測抗氧化肽的活性位點，進一步明確肽的構效關系，深入了解其抗氧化作用機制。

3 谷物源抗氧化肽的應用

3.1 在食品工業(yè)中的應用

脂質(zhì)氧化會導致食品營養(yǎng)價值損失、色澤破壞，還會產(chǎn)生異味和有害物質(zhì)。因此，為防止或延緩食品在生產(chǎn)及貯運過程中的氧化作用，通常會在食品中添加化學合成抗氧化劑，這可能會危害消費者健康。相比化學合成抗氧化劑而言，天然食源性抗氧化肽安全性更高，且不會對食品風味和色澤產(chǎn)生影響，成為食品添加劑行業(yè)的研究熱點。研究表明，谷物源抗氧化肽具有較好的抗氧化活性，可以替代化學合成抗氧化劑加入到食品中發(fā)揮作用。如在肉制品中加入谷物源抗氧化肽可以有效延長其貨架壽命[45]；在散裝油及乳狀液中摻入米糠蛋白水解產(chǎn)物可以改善其氧化穩(wěn)定性[46]。

雖有研究證明了蛋白活性肽的抗氧化潛力，但迄今為止投入應用的抗氧化肽仍較少，主要是存在產(chǎn)品風味差(如具有苦味)、食品加工過程中活性易喪失等問題，因此，對于谷物源抗氧化肽在食品中應用的研究仍是具有挑戰(zhàn)性工作。

3.2 在日化工業(yè)中的應用

經(jīng)紫外線輻射產(chǎn)生的ROS會引起皮膚膠原蛋白及皮膚細胞的氧化，通過促進角質(zhì)細胞和纖維細胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase，MMP-1)活性而引起皮膚光老化，造成皮膚干燥、粗糙和皮膚松弛等問題[47]。具有抗氧化活性的物質(zhì)(如抗氧化肽)可有效防止ROS引起的皮膚氧化應激損傷。因此，在化妝品中加入抗氧化肽不僅可以增加化妝品穩(wěn)定性，還能賦予其抗皮膚氧化功效。

消費者對于天然的具有保護皮膚功能作用產(chǎn)品的需求，使得具有生物活性的新型化妝品發(fā)展迅速。研究表明，谷物蛋白(如米糠蛋白、玉米蛋白)水解產(chǎn)物中含有的氨基酸(如脯氨酸、組氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等)生物活性肽起著重要的抗氧化作用[48]，谷物源抗氧化肽具有較強的DPPH自由基清除能力、·OH清除能力，能有效修復皮膚的氧化應激損傷。

3.3 其他方面的應用

抗氧化肽不僅具有豐富的營養(yǎng)價值，還具有多種生理功能。ROS引起氧化應激會誘發(fā)多種代謝性疾病，因此需要維持體內(nèi)氧化平衡。目前，谷物源抗氧化肽已應用于藥物開發(fā)[49]。此外，抗氧化肽還可以像蛋白、氨基酸一樣添加到飼料中。谷物源抗氧化肽已被證實可作為飼料添加劑，如在鵝飼料中添加玉米抗氧化肽，可以提高鵝的抗氧化能力，減少氧化損傷[50]。通過酵母菌發(fā)酵玉米蛋白，得到的抗氧化肽可用于乳仔豬飼料中以緩解氧化應激反應[51]。

4 結語

谷物蛋白作為抗氧化肽的底物蛋白，具有來源廣泛、安全性高、成本低的特點，在功能食品、日化產(chǎn)品、生物醫(yī)藥等領域中的市場價值非常巨大。隨著科技的發(fā)展，各種新技術帶來的谷物源抗氧化肽的功能活性的研究更加深入，部分谷物源抗氧化肽的生物學效應已經(jīng)確定，谷物源抗氧化肽的開發(fā)和利用表現(xiàn)出更開闊的應用前景。谷物源抗氧化肽的制備方法對其生物利用度的影響，以及抗氧化肽的生物有效性、安全性和致敏性仍需要進一步深入開展研究。

但目前對谷物源抗氧化活性肽的研究依然不足，阻礙了其開發(fā)利用及發(fā)展。首先，用于制備谷物源抗氧化肽的方法以酶水解法為主，這種方法存在操作復雜、效率低、產(chǎn)生苦味等缺點，利用酶水解法水解谷物蛋白得到的活性肽存在氨基酸組成相似，但活性相差較大的問題，為后續(xù)的分離純化增加了難度；其次，對谷物源抗氧化肽的研究多處于試驗階段，并未投入實際生產(chǎn)；最后，對谷物源抗氧化肽的構效關系研究仍存在難點，包括抗氧化肽可能的活性位點預測、肽中氨基酸組成、排列順序、分子質(zhì)量大小與抗氧化活性的影響機制等仍有待于探索。