沙棘果高效薄層色譜分析及抗氧化能力研究

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是胡頹子科，沙棘屬落葉性灌木[1-2]。在我國(guó)分布范圍廣，具有耐旱、抗風(fēng)沙的特點(diǎn)，被廣泛用于水土保持。沙棘果實(shí)大部分為圓球形、橙黃色[3]。沙棘具有止咳祛痰、消食化滯、活血化瘀等功效[4]。沙棘中營(yíng)養(yǎng)和生物活性物質(zhì)較豐富，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等其他國(guó)民經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域[5-8]。沙棘中含有大量的有機(jī)酸，其中蘋果酸和奎寧酸占總酸的90%以上[9-11]。沙棘為藥食同源植物，抗氧化性能強(qiáng)，開發(fā)前景廣[12-15]。

本研究通過(guò)展開條件的優(yōu)化，建立專屬性強(qiáng)、靈敏度高的高效薄層色譜掃描法對(duì)S1～S10產(chǎn)地沙棘果中蘋果酸和奎寧酸進(jìn)行定性和定量分析；采用紫外法測(cè)定了沙棘果對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、超氧陰離子自由基的清除率，為沙棘藥食同源相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣品

奎寧酸(批號(hào)：200303，純度≥98%)，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；DL-蘋果酸(分析純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；DPPH(批號(hào)：217-591-8)，東京化工產(chǎn)業(yè)；二氯甲烷，分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；乙酸乙酯、甲酸均為分析純，上海山浦化工有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為蒸餾水；10 cm×20 cm高效硅膠G板，安徽良臣硅源材料有限公司；10 cm×20 cm高效硅膠G板、H板、GF254板，青島海洋化工有限公司；聚酰胺薄膜，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠。

沙棘選自新疆青河(S1)、內(nèi)蒙烏海(S2)、山西文水(S3)、陜西神木(S4)、青海祁連(S5)、甘肅隴縣(S6)、山東滕州(S7)、吉林大安(S8)、河南淮陽(yáng)(S9)、安徽亳州(S10)10個(gè)產(chǎn)地。S1～S10，亳州市華云中藥飲片有限公司(經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和主任藥師鑒定為胡頹子科、沙棘屬)。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；Camag Linomat 5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀、Camag TLC 3掃描儀、REPROTAR 3薄層色譜照相儀，瑞士卡馬公司。

1.3 薄層掃描方法

1.3.1 溶液的制備

1.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定10 mg蘋果酸與奎寧酸，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.1.2 樣品溶液的制備

參照文獻(xiàn)[16]取沙棘果粉末2 g，加入20 mL乙醇，超聲30 min后，過(guò)濾，濾液蒸干后加2 mL甲醇，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即為樣品。

1.3.1.3 顯色劑的制備

稱取溴甲酚綠1 g，加乙醇至1 L，溶解制成1 g/L的溴甲酚綠乙醇溶液，調(diào)pH至5.4。

1.3.2 色譜程序

將硅膠G板在105 ℃下活化15 min。采用Camag Linomat 5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀進(jìn)行條帶點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為2 μL，條帶寬為6 mm，條帶間距為10.9 mm，點(diǎn)樣距底端為8 mm，左右邊距40 mm，樣品溶劑為甲醇，載氣為氮?dú)?，速率?50 nL/s。點(diǎn)樣后，在展開劑為V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)=5∶6∶2.5的條件下，將點(diǎn)樣后的硅膠G板飽和30 min，展開，取出，晾干，將其完全浸潤(rùn)至1 g/L溴甲酚綠乙醇溶液中，迅速撈出，熱風(fēng)吹干，加熱至斑點(diǎn)明顯后置日光燈下觀察，結(jié)果見圖1。由圖1可知，蘋果酸Rf值為0.59±0.05，奎寧酸Rf值為0.45±0.05，10個(gè)不同產(chǎn)地沙棘果樣品中具有與蘋果酸、奎寧酸Rf值相等的斑點(diǎn)，表明沙棘果中含有蘋果酸和奎寧酸。采用CamagTLC3掃描儀，在200～700 nm進(jìn)行雙波長(zhǎng)(540、618 nm)背景校正、全波長(zhǎng)掃描，狹縫寬度4.00 mm×0.3 mm，掃描速度200 mm/s，展距85 mm，距底8 mm，燈為氘燈和鎢燈。

Ma-蘋果酸；Qa-奎寧酸；S1～S10-樣品
圖1 618 nm下高效薄層色譜圖
Fig.1 High-performance thin-layer chromatogram at 618 nm

1.3.3 方法學(xué)考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液在同一薄層板上點(diǎn)樣6針，點(diǎn)樣量為4 μL，點(diǎn)于同一塊硅膠G板上，按照1.3.2方法展開后，掃描斑點(diǎn)，測(cè)定峰面積值，對(duì)其進(jìn)行線性關(guān)系考察、精密度考察；分別在90 min內(nèi)，每隔15 min測(cè)定一次蘋果酸和奎寧酸的峰面積，考察穩(wěn)定性；取同沙棘果樣品(S6)溶液6份，考察重復(fù)性；取沙棘果樣品(S6)6份，根據(jù)測(cè)得沙棘果樣品的含量，加等量蘋果酸、奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定回收率。

1.3.4 含量測(cè)定

將沙棘果樣品S1～S10點(diǎn)于同一薄層板上，根據(jù)1.3.2實(shí)驗(yàn)方法操作，以測(cè)得的峰面積值進(jìn)行含量計(jì)算。

1.4 抗氧化能力評(píng)價(jià)

1.4.1 樣品溶液的制備

取沙棘果粗粉2 g(過(guò)50目篩)，第1次加60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇30 mL加熱回流2 h，過(guò)濾，剩余殘?jiān)俜謩e加熱回流2次，每次1 h，合并3次濾液定容至100 mL，稀釋50倍，即為供試品溶液。

1.4.2 DPPH自由基清除試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[17-18]將沙棘果提取物溶液分別稀釋成系列濃度，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，取3 mL沙棘果提取物溶液與2 mL的DPPH溶液混勻后，背光處?kù)o置30 min。用無(wú)水乙醇作空白，在516 nm下檢測(cè)OD值。每個(gè)沙棘果樣品平行測(cè)3次，DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

DPPH自由基清除率

(1)

式中：A2，取3 mL沙棘果提取物溶液與2 mL的DPPH溶液反應(yīng)后測(cè)得的OD值；A1，取3 mL沙棘果提取物溶液與2 mL的無(wú)水乙醇溶液反應(yīng)后測(cè)得的OD值；A0，取3 mL無(wú)水乙醇溶液與2 mL的DPPH溶液反應(yīng)后測(cè)得的OD值。

1.4.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[19-20]將沙棘果提取物溶液分別稀釋成系列濃度，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，取0.2 mL沙棘果提取物溶液與3.9 mL的ABTS溶液混勻后，背光處?kù)o置15 min。用無(wú)水乙醇扣除空白，在734 nm處檢測(cè)OD值。每個(gè)沙棘果樣品平行測(cè)3次，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率計(jì)算如公式(2)所示：

ABTS陽(yáng)離子自由基清除率

(2)

式中：A2，取0.2 mL沙棘果提取物溶液與3.9 mL的ABTS溶液反應(yīng)后測(cè)得的OD值；A1，取0.2 mL沙棘果提取物溶液與3.9 mL的無(wú)水乙醇溶液反應(yīng)后測(cè)得的OD值；A0，取0.2 mL無(wú)水乙醇溶液與3.9 mL的ABTS溶液反應(yīng)后測(cè)得的OD值。

清除試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[21]將沙棘果提取物溶液分別稀釋成系列濃度，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，取1 mL沙棘果提取物溶液與2.5 mL的Tris-HCl溶液混勻后在25 ℃下水浴20 min，再加入1 mL的鄰苯三酚溶液混勻后在25 ℃下水浴6 min，最后加入0.1 mL濃HCl(8 mmol/L)終結(jié)反應(yīng)。用超純水作空白，在320 nm處檢測(cè)OD值。每個(gè)沙棘果樣品平行測(cè)3次，清除率計(jì)算如公式(3)所示：

清除率

(3)

式中：A2，取1 mL沙棘果提取物溶液與2.5 mL的Tris-HCl溶液混勻后在25 ℃下水浴20 min，再加入1 mL的鄰苯三酚溶液混勻后在25 ℃下水浴6 min，最后加入0.1 mL濃HCl(8 mmol/L)終結(jié)反應(yīng)后測(cè)得的OD值；A1，在A2的基礎(chǔ)上用1 mL的超純水代替鄰苯三酚，反應(yīng)后測(cè)得的OD值；A0，在A2的基礎(chǔ)上用1 mL的超純水代替沙棘果提取物溶液，反應(yīng)后測(cè)得的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

根據(jù)1.3.2色譜程序操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品用TLC掃描儀在200～700 nm處掃描，最終確定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在618 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見圖2-a和圖2-b。

a-蘋果酸；b-奎寧酸
圖2 蘋果酸和奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品(S6)全波長(zhǎng)掃描圖
Fig.2 Full wavelength scans of malic acid and quinic acid standard and sample (S6)

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系

試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，蘋果酸在5～55 μg線性關(guān)系良好；奎寧酸在10～80 μg線性關(guān)系良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系
Table 1 Linear relationship of standard products

2.2.2 精密度

蘋果酸峰面積平均值為12 150.63，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值為1.3%；奎寧酸峰面積平均值為4 617.90，RSD值為0.2%。結(jié)果表明該儀器具有良好的精密度(表2)。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果
Table 2 The results of precision test

2.2.3 穩(wěn)定性

蘋果酸、奎寧酸RSD值分別為0.6%、1.1%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沙棘果樣品溶液在90 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Table 3 The results of stability test

2.2.4 重復(fù)性

蘋果酸和奎寧酸RSD值分別為1.1%、0.2%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沙棘果樣品溶液重復(fù)性良好,結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
Table 4 The results of repeatability test

2.2.5 加標(biāo)回收率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘋果酸平均回收率為(99.71+1.76)%；奎寧酸平均回收率為(100.26+2.16)%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘋果酸和奎寧酸回收率良好，結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果 單位：%

Table 5 The results of recovery experiment(n=9)

2.3 含量測(cè)定

在618 nm處掃描標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的掃描(圖3、圖4)，以測(cè)得的峰面積值進(jìn)行含量測(cè)定(表6)。利用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小顯著差別(least significant difference，LSD)方差分析，并在此基礎(chǔ)上采用Origin繪圖工具繪制顯著性差異標(biāo)記柱形圖，結(jié)果見圖5。通過(guò)分析比較，發(fā)現(xiàn)10個(gè)不同產(chǎn)地中，S1與S3產(chǎn)地，S2和S4、S6產(chǎn)地的沙棘果蘋果酸含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，其余每2個(gè)產(chǎn)地之間均有顯著性差異(P<0.05)；其中S10產(chǎn)地蘋果酸的含量最高為18.7 μg/g，S7產(chǎn)地蘋果酸含量最低為6.09 μg/g；10個(gè)不同產(chǎn)地沙棘果中，S4與S5、S6產(chǎn)地，S5和S6、S8產(chǎn)地的奎寧酸含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，其余每2個(gè)產(chǎn)地之間均有顯著性差異(P<0.05)；S10產(chǎn)地奎寧酸的含量最高為44.95 μg/g，S1產(chǎn)地奎寧酸含量最低為13.69 μg/g。這可能與生長(zhǎng)地區(qū)氣候、土壤環(huán)境等有一定的關(guān)系。

a-混合標(biāo)準(zhǔn)品；b-樣品
圖3 雙波長(zhǎng)(540、618 nm)下蘋果酸和奎寧酸混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品(S6)掃描圖
Fig.3 Scans of malic acid, quinic acid, and samples (S6) at dual wavelengths (540, 618 nm)

圖4 雙波長(zhǎng)(540、618 nm)下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品(S1～S10)3D掃描圖
Fig.4 3D scans of standards and samples (S1-S10) at dual wavelengths (540, 618 nm)

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果
Table 6 The results of content determination in samples(n=3，X±SD)

圖5 S1～S10沙棘果中蘋果酸和奎寧酸含量方差分析結(jié)果
Fig.5 Variance analysis results of malic acid and quinic acid contents in S1～S10 Hippophae rhamnoides L.fruits
注：*表示P>0.05，**表示P<0.05，對(duì)S1～S10進(jìn)行兩兩比較

2.4 抗氧化結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基抗氧化結(jié)果

根據(jù)1.4.2的試驗(yàn)方法考察S7～S10的DPPH自由基清除率，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，S7～S10沙棘果提取物對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除活性，且與其具有一定的量效關(guān)系。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，S7～S10沙棘果提取物DPPH自由基的IC50為0.11～0.13 mg/mL，其中S7～S10的最大清除率為93.71%～96.27%，僅次于維生素C，說(shuō)明沙棘果提取物對(duì)DPPH自由基清除能力在一定濃度范圍內(nèi)確實(shí)具有較好的劑量依賴性。

圖6 沙棘提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用
Fig.6 The scavenging effect of Hippophae rhamnoides L.
extract on DPPH

2.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基抗氧化結(jié)果

根據(jù)1.4.3的試驗(yàn)方法考察S7～S10的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率，試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，S7～S10沙棘果提取物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基具有較強(qiáng)的清除活性，且與其具有一定的量效關(guān)系。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，S7～S10沙棘果提取物ABTS陽(yáng)離子自由基的IC50為0.11～0.61 mg/mL，其中S7～S10的最大清除率為92.18%～99.39%，僅次于維生素C，說(shuō)明沙棘果提取物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力在一定濃度范圍內(nèi)確實(shí)具有較好的劑量依賴性。

圖7 沙棘提取物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用
Fig.7 Scavenging effect of Hippophae rhamnoides L.
extract on ABTS

抗氧化結(jié)果

根據(jù)1.4.4的試驗(yàn)方法考察S7～S10的清除率，試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，S7～S10沙棘果提取物對(duì)具有較強(qiáng)的清除活性，且與其具有一定的量效關(guān)系。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，S7～S10沙棘果提取物的IC50為1.80%～2.90 mg/mL，其中S7～S10的最大清除率為81.92%～100.07%，僅次于維生素C。說(shuō)明沙棘果提取物對(duì)清除能力在一定濃度范圍內(nèi)確實(shí)具有較好的劑量依賴性。

圖8 沙棘提取物對(duì)的清除作用
Fig.8 The scavenging effect of Hippophae rhamnoides L.

3 討論

前處理?xiàng)l件：試驗(yàn)操作過(guò)程中，待薄層板展開完全，將其浸潤(rùn)至1 g/L溴甲酚綠乙醇溶液中，迅速撈出，熱風(fēng)吹干，加熱至斑點(diǎn)明顯后置日光燈下觀察，若采用噴霧瓶噴灑顯色劑會(huì)導(dǎo)致顯色不均勻從而使得雙波長(zhǎng)掃描時(shí)產(chǎn)生較大誤差，故采用浸潤(rùn)顯色。顯色時(shí)應(yīng)當(dāng)將顯色劑pH調(diào)至5.4，掃描時(shí)選擇雙波長(zhǎng)掃描，保證處于背景校正模式，才能展現(xiàn)出良好的分離效果。

薄層板選擇：本試驗(yàn)先后考察了高效薄層硅膠G板、H板、GF254板和聚酰胺薄膜對(duì)沙棘果中蘋果酸和奎寧酸分離效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明G板分離效果最佳。又分別考察了安徽良臣和青島海洋高效薄層硅膠G板，表明安徽良臣硅膠G板分離效果最佳。

條件選擇：以乙醇為溶劑對(duì)樣品超聲提取30 min，在V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)=5∶6∶2.5條件下展開，其斑點(diǎn)信息多且清晰，分離效果較好。此外，試驗(yàn)過(guò)程中需將溫度控制在5～20 ℃、濕度控制在10%～20%。此時(shí)，展開的斑點(diǎn)較多，分離效果好。不同產(chǎn)地沙棘果中蘋果酸和奎寧酸含量具有一定差異，如S9、S10沙棘果的斑點(diǎn)顏色較深且清晰，而S1和S4沙棘果的斑點(diǎn)較小且顏色較淡，表明溫度、濕度、光照等環(huán)境因素對(duì)沙棘果的化學(xué)成分影響較大[22]。

抗氧化試驗(yàn)過(guò)程中，DPPH溶液配制建議使用棕色容量瓶或者外層包裹錫紙，防止其分解；ABTS溶液配制時(shí)靜置16 h后調(diào)整吸光度至0.7±0.02，且需盡快完成試驗(yàn)避免因溶液的穩(wěn)定性造成較大的試驗(yàn)誤差；試驗(yàn)中應(yīng)遵守酸入水原則，防止過(guò)量產(chǎn)熱造成安全隱患；以上試驗(yàn)均需避光反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究建立了一種利用高效薄層色譜掃描法對(duì)S1～S10產(chǎn)地沙棘果中蘋果酸和奎寧酸進(jìn)行定性和定量分析的方法，測(cè)定沙棘果中蘋果酸和奎寧酸的含量。結(jié)果顯示，10個(gè)產(chǎn)地沙棘果中蘋果酸含量為7.28～18.70 μg/g；奎寧酸含量為13.69～44.95 μg/g。方法學(xué)考察結(jié)果均符合相關(guān)規(guī)定。抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明S7～S10產(chǎn)地DPPH自由基的IC50為0.11～0.13 mg/mL，其中S7～S10的最大清除率為93.71%～96.27%；ABTS陽(yáng)離子自由基的IC50為0.11～0.61 mg/mL，其中S7～S10的最大清除率為92.18%～的IC50為1.80～2.90 mg/mL，其中S7～S10的最大清除率為81.92%～100.07%；DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均僅次于維生素C,表明沙棘果是具有高抗氧化性能的藥食同源植物。本研究所建立的方法更易于廣泛推廣沙棘果的快速檢測(cè)，在一定程度上豐富沙棘果的鑒別方法，為沙棘果的質(zhì)量控制提供一定參考。本研究采用試劑均為低毒性，對(duì)人體和自然環(huán)境友好。