黃金茶紅茶加工過程中香氣成分及其相關酶活性的動態(tài)變化

除滋味、色澤(茶湯與干茶)之外，香氣也是評估紅茶風味品質、產品等級和品質優(yōu)劣的一個重要指標，其實質是不同種類及比例的揮發(fā)性有機化合物綜合作用的結果[1-2]。這些揮發(fā)性化合物一方面來源于茶樹自身的酶促反應，另一方面則源自茶葉加工過程中發(fā)生的一系列化學反應[3]。

紅茶屬于全發(fā)酵茶，萎凋及發(fā)酵工序使其香氣的形成與轉變較其他茶類更為充分，因此，形成的香氣種類繁多且含量豐富[4]。存在茶鮮葉中的芳香物質約80種，且以具青草氣味的青葉醇為主，而迄今為止，已檢測鑒定出的紅茶香氣物質達400余種[5]?？梢娫诩t茶眾多的香氣組合中，僅有極少數來源于茶鮮葉中的游離態(tài)香氣成分。絕大部分是由存在于鮮葉中的香氣前體物質在多種酶的催化下，在茶葉加工過程中進行一系列的酶促氧化，發(fā)生聚合或縮合反應，產生種類豐富的芳香物質，最終形成紅茶優(yōu)良的香氣品質[6]。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，β-GC)、醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)對紅茶香氣的形成起著重要作用。β-GC作為一種水解酶，可將糖苷類物質水解成游離態(tài)香氣，而LOX則將亞麻酸、亞油酸等脂肪酸類物質氧化形成β-氫氧化物，再經脂氫過氧化物裂解酶(hydroperoxidelyase，HPL)催化形成順-3-己烯醛，最終經ADH的催化還原作用形成順-3-己烯醇(青葉醇)，再經氧化降解形成小分子的醛、酮、酸等化合物，成為構成紅茶香氣的物質之一[7-8]。

保靖黃金茶發(fā)源于湖南省湘西自治州保靖縣葫蘆鎮(zhèn)黃金村，內含物質豐富，制成的紅茶茶黃素、氨基酸、糖類物質含量高，近年來，成為湖南省主要種植及紅茶加工的茶樹品種。但由于飲茶和消費的影響，黃金茶紅茶興起較晚，加工工藝有待優(yōu)化，產品品質參差不齊[9]。因此，本研究以保靖黃金茶加工的紅茶為研究對象，探究在紅茶不同加工過程中β-GC、ADH、LOX的活性及各種香氣組分含量的變化，以期進一步豐富保靖黃金茶紅茶的品質理論，為其加工過程中的品質調控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品制作

鮮葉原料均采自湖南湘西妙古金茶葉公司茶園，品種為保靖黃金茶，原料等級為一芽二葉，采摘時間為2020年8月上旬。

樣品加工流程：

鮮葉萎凋(室內萎凋，鮮葉薄攤2～3 cm，平均氣溫20 ℃，至鮮葉含水量為62%～63%止揉捻(不加壓5 min、輕壓10 min、重壓10 min、輕壓5 min、重壓10 min、輕壓5 min)發(fā)酵(發(fā)酵室，溫度28 ℃、相對濕度90%以上，發(fā)酵4 h)干燥(鏈板式烘干機、毛火溫度120 ℃、足火溫度100 ℃至足干)

取樣：于鮮葉、萎凋、揉捻、發(fā)酵等4個加工過程取樣，取樣后將樣品迅速用液氮固定、置于-80 ℃貯存待進一步分析。

1.2 儀器與設備

5424R型Eppendorf臺式高速冷凍離心機，艾本德生命科技有限公司；Biotek Epoch全波長酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；移液槍、96孔板、AE240型Mettler電子分析天平，瑞士Mettler儀器有限公司；DK-S24型恒溫水浴鍋，上海精宏有限公司；全自動樣品快速研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；QP2010型GC-MS，日本島津公司；手動SPME進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司；ADH試劑盒、LOX試劑盒、β-GC試劑盒，蘇州科銘生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 β-GC、ADH、LOX活性測定

樣品前處理：用離心管稱取0.1 g試樣置于快速研磨儀進行研磨。

酶活性測定：LOX、ADH、β-GC 3種酶活性的測定均按照試劑盒步驟操作。

1.3.2 香氣檢測

采用固相微萃取-氣質聯用技術(solid-phase microextraction/GC-MS，SPME/GC-MS)進行分析。

前處理：固相微萃取頭經240 ℃老化45 min后備用。稱取2 g粉碎后的茶樣，裝入15 mL萃取瓶中,以四氟乙烯封口，于80 ℃恒溫水浴中平衡10 min，吸附50 min后，在250 ℃下解析5 min。

GC條件：石英色譜柱(0.25 μm×60.0 m×0.25 mm)，柱溫箱溫度：60.0 ℃，不分流進樣，進樣量1 μL，進樣溫度250 ℃，樣品流速1.96 mL/min，升溫程序60 ℃保留5 min，3 ℃/min升至140 ℃保留5 min，10 ℃/min升至230 ℃保留5 min，10 ℃/min升至260 ℃保留5 min，載氣為高純度He。

MS條件：溫度200 ℃，色譜接口溫度220 ℃，電子轟擊離子源，質核比范圍：45～500 m/z。

利用NIST標準譜庫對GC-MS分析得到的色譜峰信息進行串聯檢索和人工解析，根據相對保留時間進行物質鑒定，按照面積歸一法計算所檢測到的各組分的相對含量。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2019、SPSS 26軟件進行數據歸類、分析和計算，Origin 2019、GraphPad Prism 8.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 加工過程中β-GC、ADH、LOX活性變化

如圖1所示，β-GC在萎凋期間活性隨萎凋時間的延長而增加，萎凋結束時增加至88.73 nmol/(min·g)，達到鮮葉的1.39倍；經揉捻工序后，酶活性開始呈下降趨勢，相比萎凋工序降幅達17.8%；發(fā)酵時，β-GC活性降幅高于揉捻工序達65.8%。萎凋期間ADH活性逐步增強，特別是在萎凋結束，達到鮮葉ADH酶活性的3.25倍，增幅最大；經揉捻后，酶活性降至萎凋葉的40%左右；發(fā)酵過程中，酶活性呈持續(xù)下降趨勢。隨著萎凋時間的增加，LOX酶活性整體上逐漸增強，萎凋結束時達鮮葉酶活性的3.56倍，是整個加工過程中酶活性的最高點；揉捻結束后活性迅速降低，為萎凋葉的41%；發(fā)酵過程中酶活性持續(xù)而緩慢的下降。這表明，在紅茶加工過程中，β-GC、ADH、LOX 3種酶的酶活性變化趨勢呈現相似的變化規(guī)律，酶活性從鮮葉到萎凋結束持續(xù)增加直至揉捻初期最高，隨后在揉捻后期、發(fā)酵工序中急劇下降。這可能是由于萎凋期間鮮葉水分散失，酶及其作用底物相對含量升高，pH下降，酶活性增強[10]；酚類及其氧化中間產物是蛋白質的天然沉淀劑，揉捻階段，葉細胞破損，使得酚類物質大量析出，降低了酶的活性。發(fā)酵過程中，底物和酶開始接觸并發(fā)生酶促反應，酶底物含量減少，從而使酶活性下降[11]。

β-GC能促進茶葉中糖苷類香氣前體物質的水解以及形成萜烯醇類和芳香醇類的化合物，釋放大量的香葉醇、芳樟醇等游離態(tài)揮發(fā)性物質，從而形成紅茶的特征香氣[12]。劉莉華等[13]的研究結果表明，在加工過程中，紅碎茶的β-GC活性在萎凋結束時達到最高，之后持續(xù)下降；而工夫紅茶則是從萎凋結束至揉捻初期酶活性最高，且低溫有利于酶活性的保持。在紅茶發(fā)酵過程中，β-GC的活性明顯受溫度的影響，溫度的增幅與其活性下降速率呈正相關；與高溫條件(25 ℃)相比，處于較低溫度(20 ℃)下的β-GC活性下降速率明顯減緩。因此，適當的低溫發(fā)酵可保持β-GC活性，有利于紅茶香氣的形成[14]。項麗慧等[15]進行了紅茶的黃光萎凋試驗，結果發(fā)現，在萎凋期間補充黃光，可在前期促進萎凋葉香氣的相關酶基因上調表達從而使β-GC活性在萎凋后期得到提高，最終使得紅茶呈甜花香。在紅茶制造過程中，LOX與ADH協同作用于催化亞麻酸和亞油酸氧化形成正己醛、己烯醇及己烯醛等化合物，參與紅茶香氣構成。LOX是一種能氧化不飽和脂肪酸生成不飽和脂肪酸過氧化物的生物催化劑，其活性的高低是導致不同地區(qū)茶鮮葉香氣成分差異的原因之一[16]。有研究指出[7]，ADH的活性受基因Cs ADH的調控，在茶葉萎凋過程中，葉片和莖的損傷脅迫誘導使Cs ADH基因表達，促進青葉醇等C6芳香物質的積累。

a-β-GC活性；b-ADH活性；c-LOX活性
圖1 紅茶加工過程中纖β-GC、ADH、LOX的酶活性變化
Fig.1 Changes of β-GC, ADH and LOX enzyme activities during black tea processing

2.2 加工過程中的香氣類別的變化

本試驗共檢測到263種香氣組分，包括53種醇、53種烯烴、70種烷烴、36種酯、14種酮、17種醛和20種其他類化合物，其中，鮮葉、萎凋、揉捻、發(fā)酵等工序中分別檢測出138、136、137、122種香氣成分。如圖2所示，整個加工過程中香氣成分以醇類為主，揉捻葉樣品中醇類揮發(fā)物所占比例最高，其中芳樟醇、香葉醇、四氫-α,α,5-三甲基-5-乙烯基呋喃-2-甲醇、反式-橙花叔醇、苯乙醇相對含量較高；烯烴類在鮮葉中所占比例最高，然后逐漸降低，經揉捻工序后含量略有上升，發(fā)酵后又有所下降。值得注意的是，具有花香氣味的α-法尼烯是所有樣品中含量最豐富的烯烴，其含量顯著高于其他樣品。酯類所占比例僅次于醇類，在鮮葉中含量最高。令人驚訝的是，在加工過程中，酯類的比例變化與醇的相似，在加工過程中含量變化趨勢為從降低到升高再降低；醛類在萎凋葉中比例最低，在發(fā)酵葉中比例最高；酮類物質的含量從鮮葉開始至整個加工過程中逐漸升高，并在整個生產過程中保持穩(wěn)定。此外，烷烴類化合物在鮮葉和萎凋葉中比例較高，揉捻和發(fā)酵時含量下降且趨于穩(wěn)定，從萎凋到揉捻，烷烴類化合物含量降幅約為30%。

從鮮葉狀態(tài)到發(fā)酵結束，香氣組成和相對含量均有明顯差異，最顯著的變化趨勢是烷烴類成分、烯烴類和酮類化合物成分相對含量的急劇降低以及香氣組分中醛類、酯類等成分的持續(xù)增加。導致這種變化的直接原因可能是加工過程中，糖苷水解、類胡蘿卜素、氨基酸或脂質降解等釋放的揮發(fā)性化合物使不同類別的香氣成分發(fā)生降解或生成[4]。

圖2 紅茶加工過程中的香氣類別的變化
Fig.2 Changes in aroma categories during black tea processing

2.3 加工過程中主要香氣組分及相對含量變化分析

通過GC-MS技術分離鑒定到主要的47種香氣成分，如表1所示，其中醇類12種、酮類7種、醛類8種、酯類7種、烷烴類3種、烯烴類化合物7種和其他化合物3種。這47種香氣組分中有23種成分具有相同變化趨勢，其中11種在加工過程中相對含量逐漸升高，分別為苯甲醇、異香葉醇、α-衣蘭油烯、苯甲醛、反式-2-壬烯醛、反-2-辛烯醛、β-環(huán)檸檬醛、甲基庚烯酮、3,5-辛二烯-2-酮、α-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯。12種在加工過程中相對含量降低，分別為6-異辛醇、芳樟醇、α-松油醇、2-甲基十四烷、正十三烷、正十四烷、α-法尼烯、(3E,7E)-4,8,12-三甲基三苯甲基-1,3,7,11-四烯、羅勒烯、反式-2-癸烯醛、β-紫羅蘭酮、茉莉酸甲酯，其余24種香氣組分均呈不規(guī)則的變化趨勢。

2.3.1 醇類的變化分析

醇類化合物主要分為脂肪族醇、芳香族醇和萜烯醇3類，而具有花果香的萜烯醇是紅茶香氣中的重要成分之一[17]。在本研究中，相對含量較高的醇類有苯乙醇(3.83%～5.08%)、香葉醇(4.13%～9.13%)、反式-橙花叔醇(1.99%～5.64%)、芳樟醇(24.52%～34.38%)等，其中，具有鈴蘭花香的芳樟醇是紅茶中含量較高的香氣組分之一，對紅茶香型形成有重要作用。鮮葉中，芳樟醇的相對含量為34.15%，在揉捻和發(fā)酵時有較大程度的降低，這與楊娟等[18]研究結果不同，這可能是加工工藝和茶樹品種不同所致。散發(fā)玫瑰香的香葉醇是祁門紅茶和福建紅茶的特征性香氣成分，在鮮葉中相對含量為5.79%，之后呈波動性變化。苯乙醇具有玫瑰香，揉捻葉中含量最高(5.08%)，發(fā)酵后降至(4.86%)，但其閾值較高(750～1 100 μg/L)，對紅茶香氣形成的影響需進一步研究[19]。竹尾忠一等[20]認為，中國紅茶的香型分為三類：第1種是芳樟醇及其氧化物主導型，第2種是香葉醇和芳樟醇綜合的中間型，第3種是香葉醇主導型?？梢园l(fā)現，在黃金茶紅茶的4個加工階段中，芳樟醇的相對含量均顯著高于香葉醇，初步推測其香氣特征可能屬于芳樟醇及其氧化物主導型。

2.3.2 醛類、酯類的變化分析

紅茶中含有大量揮發(fā)性物質，包括來源于飽和及不飽和脂肪酸的醛和酯[21]。酯類分為萜烯酯類和芳香族酯類，通常具有強烈而令人愉快的花香；醛類與紅茶香型的形成密切相關，主要包括脂肪族醛、芳香族醛和萜烯醛[5]。如表1所示，酯類在加工過程中總體呈波動性變化趨勢，其相對含量僅次于醇類；醛類物質在鮮葉中含量較低，伴隨著萎凋、揉捻、發(fā)酵的進行，其相對含量逐步增高，此變化趨勢可能與醇類物質的轉化有關[5]。由表1可知，在紅茶加工過程中，相對含量較高的酯類有水楊酸甲酯(6.73%～11.92%)、(4E)-4E-己酸己酯(0.87%～1.49%)、二氫獼猴桃內酯(0%～0.36%)等，相對含量較高的醛類有苯甲醛(0.69%～1.95%)、反-2-辛烯醛(0.19%～0.75%)、庚二烯醛(0.21%～1.03%)、β-環(huán)檸檬醛(0.16%～0.43%)等。水楊酸甲酯具有濃烈的冬青油香，對茶葉的清香具有一定貢獻，在鮮葉中相對含量達7.17%，揉捻結束增至11.92%，發(fā)酵后稍有降低。二氫獼猴桃內酯具典型的烘烤香、堅果香，也是紅茶的主要香氣成分。但在鮮葉和萎凋葉中均未檢測到此物質，僅在揉捻和發(fā)酵工序中觀察到其相對含量呈上升趨勢，猜測可能是揉捻和發(fā)酵過程中胡蘿卜素的降解引起了二氫獼猴桃內酯的生成和相對含量的增加。苯甲醛通常表現為苦杏仁味，在加工過程中含量逐漸升高，但其閾值較高(350～3 500 μg/L)，對紅茶香氣品質的貢獻仍需進一步研究[22]。

表1 紅茶加工過程中主要香氣組分的變化 單位：%

Table 1 Changes of main aroma components in black tea during processing

注：-表示未檢出，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3.3 烯烴類、酮類、烷烴類和其他組分變化的變化分析

烯烴屬不飽和烴類物質，廣泛存在于植物體內，具有一定的香氣，對茶葉香型形成有較大影響[23]。黃金茶紅茶加工中，相對含量較高的萜烯類有α-法尼烯(0.18%～0.81%)、(-)-α-蓽澄茄油烯(0.17%～0.55%)等，這2類物質常表現為花香、木香[24]。酮類化合物通常具有花香味，是賦予紅茶花香特征的物質基礎。順茉莉酮、β-紫羅酮等是紅茶的特征香氣成分之一，在本研究中順茉莉酮、β-紫羅酮的相對含量分別為(0.1%～0.14%)、(0.35%～0.99%)。β-紫羅酮具有紫羅蘭香氣，主要由胡蘿卜素氧化降解和熱氧化降解產生[25]；鮮葉中，β-紫羅酮的相對含量為0.35%，在后續(xù)加工過程中呈逐漸上升狀態(tài)。表現為強烈而愉快的茉莉香的順茉莉酮，在揉捻葉中相對含量最高，隨后略有下降。AI等[26]的研究表明，在紅茶萎凋過程中補充紅、橙、黃光可明顯提高酮類香氣物質的含量。其他被檢測到的香氣組分有2-甲基十四烷、正十三烷等烷烴類物質及苯乙腈、咖啡堿、(+)-香豆素，這些物質也對紅茶香氣的形成有一定作用。

3 結論

茶葉香氣品質的形成與加工過程中關鍵酶的活性變化密切相關，本研究對黃金茶紅茶加工過程中β-GC、LOX、ADH活性變化和香氣成分的動態(tài)變化研究顯示，在黃金茶紅茶加工過程中β-GC、LOX、ADH的活性均呈現先增加后降低的趨勢，且峰值均出現在萎凋工序；經SPME/GC-MS檢測分析，共檢測到263種香氣組分，包括53種醇、53種烯烴、70種烷烴、36種酯、14種酮、17種醛和20種其他類化合物，其中醇類和酯類物質是主要的香氣種類；此外，在47種主要的香氣組分中，11種在加工過程中相對含量逐漸升高，12種在加工過程中相對含量降低，24種香氣組分均呈不規(guī)則的變化趨勢；相對含量較高的香氣組分有苯乙醇、香葉醇、反式-橙花叔醇、芳樟醇、水楊酸甲酯、(4E)-4E-己酸己酯、二氫獼猴桃內酯、苯甲醛、反-2-辛烯醛、庚二烯醛、β-環(huán)檸檬醛、α-法尼烯、(-)-α-蓽澄茄油烯、順茉莉酮、β-紫羅酮等，且黃金茶紅茶的香型可能屬于芳樟醇及其氧化物主導型。在接下來的研究工作中，應精確定量分析各香氣組分變化以及應用組學技術深入探究香氣組分與相關酶活變化的關系，進而為黃金茶紅茶的香氣品質調控提供理論支撐。