黑曲霉木聚糖酶在大腸桿菌中的胞外表達和酶學性質研究

植物細胞壁中有豐富的多糖成分，包括纖維素、半纖維素和木質素。其中，半纖維素是僅次于纖維素的可再生資源，但轉化率較低，是亟待開發(fā)的生物物質[1]。木聚糖酶是一類能將木聚糖降解為低聚木糖和木單糖的酶系。其中，β-D-1,4內切木聚糖酶(β-D-1,4 endoxylanase,xynA)(EC 3.2.1.8) 以內切的方式降解主鏈上的β-1,4糖苷鍵，生成低聚木糖。其次，β-D-1,4木糖苷酶 (EC 3.2.1.37)從還原端釋放木糖。此外，α-L-阿拉伯糖苷酶 (EC 3.2.1.55) 和α-L-葡萄糖醛酸苷酶 (EC 3.2.1.139) 催化木聚糖中支鏈糖苷鍵的斷裂，加速低聚木糖的形成[2]。在上述酶系當中，β-D-1,4內切木聚糖酶是木聚糖水解過程中的關鍵酶，受到的關注最多。

迄今為止，國內外相繼報道了約400種不同來源的xynA基因。大部分木聚糖酶基因來源于括黑曲霉[3]、米曲霉[4]和里氏木霉[5]等真菌。不同微生物來源的木聚糖酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等酶學性質差異較大[6]。真菌木聚糖酶的酶分子質量較小，在18～33 kDa，最適反應溫度和最適反應pH分別為45～60 ℃和3.0～6.5。在酶的穩(wěn)定性方面，多數真菌來源的酶在40～60 ℃較為穩(wěn)定，而pH在2.5～10.0都有較好的穩(wěn)定性[7-8]。為提高木聚糖酶的發(fā)酵水平，近百種不同來源的木聚糖酶基因已在大腸桿菌(Escherichia coli)中成功實現(xiàn)高效表達[9]。然而，木聚糖酶在E.coli中主要為胞內表達，不利于酶分離提取。

在本研究中，克隆了來源于黑曲霉(Aspergillus niger) AG11的xynA基因 (GenBank No.XM_001388485.2)，并表達于E.coli BL21(DE3)，構建得到能分泌xynA的重組菌。通過誘導條件優(yōu)化提高xynA分泌表達水平，并研究了其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

A.niger AG11、E.coli JM109、BL21(DE)感受肽細胞、質粒pET28a(+)和質粒pET22b(+)均由實驗室保藏。

1.1.2 試驗試劑

柱回收試劑盒，Thermo公司；大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、限制性內切酶、PrimerSTAR Max DNA 聚合酶，大連TaKaRa公司；氨芐青霉素、質粒提取試劑盒、真菌基因組快速提取試劑盒，上海生工公司；一步克隆試劑盒，南京諾維贊公司；酵母粉與胰蛋白胨，Oxoid 公司；底物樺木聚糖，Sigma公司(美國)；蛋白質marker和BCA蛋白濃度檢測試劑盒，上海翊圣公司；蛋白電泳Loading buffer與Bis-Tris預制凝膠，Invitrogen公司。其他常規(guī)試劑及藥品為國產或進口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：酵母提取物 5，蛋白胨 10，NaCl 5，自然pH。

PDA培養(yǎng)基 (g/L)：土豆 200，葡萄糖 20，瓊脂 15，自然pH。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑曲霉基因組的提取

將孢子懸液涂布于PDA固體培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)4～7 d。用無菌水緩慢刮取固體培養(yǎng)基表面孢子，經濾膜過濾獲得高活性的孢子懸液。將接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h。通過離心及紗布過濾收集黑曲霉菌絲體，置于滅菌的研缽中(加液氮)研磨至細小粉末，用離心管收集待用。使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取黑曲霉基因組。

1.2.2 xynA基因的克隆與表達載體的構建

以A.niger AG11基因組為模板，利用引物xynA primerF和xynA pimerR(表1)進行PCR擴增，得到xynA基因。擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸50 s，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸5 min。將PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對產物進行純化并測序。分別用Nco I和Xho I對PCR產物、pET-28a(+)和pET-22b(+)載體進行雙酶切。PCR產物經Solution I分別連接至pET-28a(+)和pET-22b(+)載體的雙酶切片段，并轉化E.coli JM109。為去除內含子，以intron primeF和intro primerR(表1)對重組載體進行擴增，所得PCR產物用磷酸化酶處理后，用Solution I連接酶連接，得到xynA表達載體pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA。其中，pET-22b(+)載體由于在多克隆位點的上游添加了信號肽序列，可將外源蛋白從大腸桿菌中高效地引導出胞外，減少包涵體形成，常被用于胞外異源表達。同時，由于pelB信號肽融合在xynA的N端，可能對xynA的表達有影響，所以需要實驗驗證。

1.2.3 重組xynA的表達

將構建的pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA轉化至E.coli BL21(DE)，得到重組菌pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)和pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)。重組菌分別接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中。經37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)12 h，再轉接至含100 μg/mL氨芐青霉素的TB發(fā)酵培養(yǎng)基中。經37 ℃，220 r/min搖瓶培養(yǎng)至OD600值為1.0時，用終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導，并于25 ℃和220 r/min下發(fā)酵24 h。

表1 本研究使用的引物
Table 1 Primers used in this study

注：下劃線為酶切位點或一步克隆對應的同源臂序列

將重組菌發(fā)酵液離心并收集菌體，用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 7.5)重懸后于冰水浴中超聲破碎(200 W，超聲3 s，間隔4 s，50次)，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心15 min后將上清液和沉淀分別測定酶活力，并進行SDS-PAGE檢測。將上清液中的目標條帶切膠回收，用MALDI-TOF/MS對樣品進行質譜分析[10]。同時將pET-22b-xynA/BL21(DE)發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE和酶活力檢測。

1.2.4 正交實驗優(yōu)化胞外表達水平

以IPTG誘導濃度、誘導溫度、誘導OD600值為xynA胞外表達的因素，設計正交試驗(表2)。將pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)重組菌在不同條件下進行發(fā)酵并比較不同條件對胞外表達的木聚糖酶的影響。并通過計算各條件下的k值和極差R，確定xynA胞外表達影響最大的因素[11]。

表2 大腸桿菌分泌表達xynA的L9(33)正交試驗表
Table 2 L9 (33) orthogonal table of the extracellular xynA expresion in E.coli

1.2.5 重組xynA的分離純化

使用鎳親和層析柱對表達的xynA進行分離純化。將重組菌發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min離心5 min。取25 mL上清液于0.22 μm水系膜過濾后，上樣至用緩沖液A(50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.5)平衡的HisTrapTM FF。用8%的緩沖液B(50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.5，500 mmol/L咪唑)沖洗純化柱后，xynA于20% B緩沖液(100 mmol/L咪唑)洗脫。用脫鹽柱Sephadex G25脫鹽，置于4 ℃保存，用SDS-PAGE檢測其純度。

1.2.6 重組xynA酶學性質測定

最適反應溫度：純化后的酶液經NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)稀釋至適當濃度，分別測定在35～60 ℃的酶活力。以最高酶活力為100%，計算各溫度下的相對酶活力。

溫度穩(wěn)定性：將上述稀釋后酶液分別在40～60 ℃條件下孵育0～90 min后置于冰上保存，測定各條件下的酶活力。以孵育0 min時的酶活力為100%，計算各孵育時間下的相對酶活力。在上述溫度穩(wěn)定性測定的基礎上擬合不同溫度下的回歸方程，計算各溫度下木聚糖酶的半衰期[12]。

最適反應pH：分別用Na2HPO4-檸檬酸(pH 2.0～5.0)、Na2HPO4- NaH2PO4(pH 6.0～7.0)、Tris-HCl(pH 8.0)和甘氨酸-NaOH(pH 9.0)緩沖液將pH調至2.0～9.0后測定酶活力。以最高酶活力為100%，計算各pH下的相對酶活力。

用上述相同的緩沖液，將酶液pH調至2.0～9.0，在40 ℃條件下孵育1 h后，再將pH調至4.0測定酶活力。以孵育0 min時的酶活力為100%，計算各孵育條件下的相對酶活力。

1.2.7 木聚糖酶酶反應動力學參數測定

在酶的最適條件下測定質量濃度為0～25 mg/mL的樺木木聚糖的初始酶活力?；谏鲜雒阜磻獢祿?，作Lineweaver-Burk雙倒數圖，計算重組木聚糖酶的Km和kcat[13]。

1.2.8 木聚糖酶酶活力和蛋白含量的測定

采用3, 5-二硝基水楊酸法測定木聚糖酶酶活力[14]。將500 μL稀釋至適當濃度的酶液與500 μL樺木木聚糖底物(pH 4.0，10 mg/mL)混合，在50 ℃條件下反應10 min后用3, 5-二硝基水楊酸試劑終止反應。反應的樣品于沸水內顯色5 min后立即用水冷卻，并在545 nm條件下測定吸光度。酶活力單位(U/mL)定義為1 min水解木聚糖所產生的1 μmol還原糖所需的酶量。蛋白濃度的測定采用了BCA法，以牛血清蛋白為標準品。

2 結果與分析

2.1 xynA基因的克隆與載體的構建

以A.niger AG11基因組為模板，通過PCR擴增xynA基因。電泳分析顯示，PCR產物大小約為750 bp，與理論值相似(圖1-a)。將PCR產物分別克隆至pET-28a(+)和pET-22b(+)-xynA的Nco I-Xho I位點，得到編碼xynA的質粒pET-28a(+)-xynA′和pET-22b(+)-xynA′。基于一步克隆法刪除pET-28a(+)-xynA′和pET-22b(+)-xynA′中xynA的內含子序列，進一步構建得到xynA表達質粒pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA(圖1-b)。其中，pET-22b(+)-xynA編碼了pelB信號肽，將促進融合在其下游xynA的分泌表達。上述表達質粒序列均經測序驗證。

M-DNA marker; 1-xynA
a-xynA基因的擴增產物核酸膠圖；b-pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA載體圖譜
圖1 xynA基因的克隆與載體構建
Fig.1 Cloning of xynA gene and vectors construction

2.2 重組xynA的表達

將pET-28a(+)-xynA載體轉入E.coli BL21(DE)中，轉接后OD600值達到1.0時添加IPTG，使終濃度為0.1 mmol/L，25 ℃發(fā)酵24 h并收集菌體。經超聲破碎，在沉淀和上清液中都有20 kDa左右的條帶(圖2-a)，但空白對照中不存在該條帶，初步判斷E.coli BL21(DE)成功表達xynA，同時存在部分包涵體。用MALDI-TOF/MS對該條帶進行質譜分析,確定為A.niger CBS 513.88來源的木聚糖酶(圖3)。對胞內上清液和沉淀分別測定酶活力，上清液中xynA活力為10.4 U/mL(圖2-c)，而沉淀中的包涵體不具有活性。

為實現(xiàn)胞外表達，將pET-22b(+)-xynA轉入E.coli BL21(DE)并進行搖瓶發(fā)酵。分別對胞外上清液、胞內上清液和沉淀進行酶活力測定和SDS-PAGE檢測(圖2-b)。結果顯示在胞外上清液中存在xynA條帶，而胞內上清液和沉淀中也存在對應條帶。其中，pelB作為大腸桿菌中高效的信號肽，被融合到xynA的N端，可將外源蛋白引導至周質空間并轉移到胞外，提高xynA的可溶性。在胞外上清液中可測得xynA活力為8.5 U/mL(圖2-c)。與空白對照組比較，在SDS-PAGE圖中可基本確定目的條帶(圖2-b)，而在不添加pelB信號肽的重組菌胞外上清液中未測得酶活力。以上結果說明，在添加信號肽后胞內部分xynA成功分泌至胞外。同時，在胞內上清液中也檢測到xynA活力為0.8 U/mL(圖2-c)，并在SDS-PAGE圖上顯示對應條帶(圖2-b)，表明胞內依然存在部分包涵體，需進一步優(yōu)化誘導條件。

M-蛋白質marker；1-pET-28a(+)胞內上清液空白對照；2-pET-28a(+)-xynA胞內上清液；3-pET-28a(+)胞內胞內沉淀空白對照；
4-pET-28a(+)-xynA胞內沉淀；5-pET-22b(+)胞內上清液空白對照；6-pET-22b(+)-xynA胞外上清液；
7-pET-22b(+)-xynA胞內上清液；8-pET-22b(+)-xynA胞內沉淀；9-純化后的xynA條帶；10-pET-28a(+)/BL21(DE)空白對照；
11-pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)胞內上清液酶活力；12-pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)胞內沉淀酶活力；13-pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)
胞外上清液酶活力；14- pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)胞內上清液酶活力；15-pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)胞內沉淀酶活力
a-pET-28a(+)-xynA在E.coli BL21(DE)中表達的SDS-PAGE圖；b-pET-22b(+)-xynA在E.coli BL21(DE)中表達的SDS-PAGE圖；
c-pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA在E.coli BL21(DE)中表達的酶活力柱狀圖
圖2 重組xynA的表達情況分析
Fig.2 Expression analysis of recombinant xynA

圖3 重組xynA的MALDI-TOF/MS檢測結果
Fig.3 MALDI-TOF/MS result of recombinant xynA

2.3 重組xynA的分泌表達優(yōu)化

分別取各組24 h和36 h時的發(fā)酵液，對比胞外上清液中的xynA活力。在IPTG誘導濃度為0.1 mmol/L、誘導溫度為20 ℃、誘導OD600值為0.5，發(fā)酵至24 h時的酶活力為10.2 U/mL，比未經優(yōu)化的條件下，發(fā)酵至24 h時的酶活力提高20%。在發(fā)酵36 h時胞外有15.8 U/mL的最高酶活力，比初始條件下提高85.9%(圖4-a)。對該組收集的細胞進行超聲破碎并進行SDS-PAGE檢測，顯示胞內沉淀中的包涵體量有較明顯的減少(圖4-b)。

對36 h時各組胞外酶活力的數據進行處理，分別計算各因素下的k值和極差R，結果如表3所示。IPTG濃度和誘導溫度的極差R高于誘導OD600值的極差，表明前2個因素對xynA胞外表達水平的影響更大。IPTG終濃度為0.1 mmol/L，誘導溫度為20 ℃時可減少包涵體的形成。但發(fā)酵36 h的胞外酶活力比24 h的酶活力高55%，說明20 ℃低溫誘導xynA需要更長的時間表達。而30 ℃發(fā)酵36 h的胞外酶活力低于24 h，較高溫度下誘導可以加速xynA的分泌表達，但發(fā)酵時間過長致使xynA部分失活。適當地降低誘導溫度，延長發(fā)酵時間可以提高xynA的可溶性表達水平。

表3 36 h發(fā)酵時間下不同因素的k值和極差R
Table 3 The k value and the range R of different factors under 36 h fermentation time

M-蛋白質marker；1-初始條件下的胞內沉淀；
2-最佳優(yōu)化條件下的胞內沉淀
a-正交試驗各組條件下胞外xynA活力柱狀圖；b-初始條件與最佳條件下胞外沉淀的SDS-PAGE圖
圖4 重組xynA胞外表達條件優(yōu)化
Fig.4 Optimizing extracellular expression of recombinant xynA

2.4 重組xynA的酶學性質

2.4.1 重組xynA的純化和動力學參數測定

對發(fā)酵液進行離心并用0.22 μm的濾膜過濾，用20%的500 mmol/L B液洗脫xynA，獲得單一的目的蛋白條帶。蛋白條帶與理論值相符，且無雜帶(圖2-b)。脫鹽后分別測定蛋白濃度和酶活力，計算得重組xynA的比酶活為175.1 U/mg。當以樺木木聚糖為底物時，測定重組xynA的動力學參數如表4所示。

表4 以樺木木聚糖為底物時的重組xynA動力學參數
Table 4 Kinetic parameters of xynA with betula xylan as substrate

2.4.2 重組xynA的最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性測定

如圖5所示，在25～60 ℃，重組xynA的酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，50 ℃時測得最高酶活力。在25～50 ℃酶活力緩慢上升，25 ℃反應條件下有60%以上的相對酶活，說明在該溫度范圍內xynA較穩(wěn)定。但當反應溫度超過50 ℃，xynA的相對酶活顯著下降，55 ℃時相對酶活力下降了40%，反應溫度為60 ℃時，相對酶活力降至50%以下 (圖5-a)。以上結果說明50 ℃ 為xynA的最適反應溫度，但當反應溫度超過50 ℃，相對酶活顯著下降，xynA在該反應溫度下表現(xiàn)出較差的酶活力。

a-重組xynA最佳反應溫度曲線；b-重組xynA溫度穩(wěn)定性曲線；c-重組xynA不同溫度下的半衰期柱狀圖；d-重組xynA最佳反應pH和pH穩(wěn)定性曲線
圖5 溫度和pH對重組xynA活性的影響
Fig.5 The influence of temperature and pH on the activity of recombinant xynA

孵育溫度為40 ℃時xynA呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，相對酶活力保持在97%以上，孵育時間為90 min時未表現(xiàn)出下降趨勢。但當溫度上升至55 ℃，孵育5 min時殘留酶活力僅為8%，10 min時xynA全部失活，而60 ℃ 孵育5 min時已檢測不到xynA的酶活力(圖5-b)。經計算得xynA在40 ℃的半衰期為182 min。而45、50、55 ℃的半衰期分別僅為40 ℃時的33.3%、10%和2.6% (圖5-c)。表明xynA在40 ℃時具有最佳的熱穩(wěn)定性，而高于40 ℃熱穩(wěn)定性顯著下降。

2.4.3 重組xynA的最適反應pH和pH穩(wěn)定性測定

當反應體系的pH為4.0時測得xynA的最高酶活力,在pH為2.0～5.0相對酶活力都高于70%，說明在該反應條件下xynA具有較高的活力。而當pH高于6.0，酶的活力有較大程度的下降，pH為9.0時，相對酶活力僅為10%(圖5-d)。由此可知，重組xynA的最佳反應pH為4.0，在酸性反應條件下具有較好的酶活力，而在堿性條件下酶的活力顯著降低。

為了測定xynA在不同pH條件下的耐受性，設定孵育pH為2.0～9.0。在pH為4.0時有最佳的相對酶活力，說明在該條件下xynA最為穩(wěn)定。而在其他pH條件下，相對酶活力保持在70%以上(圖5-d)。重組xynA具有較大范圍的pH穩(wěn)定性，在酸堿條件下保存較長時間依然具有較高的酶活力。

3 結論與討論

木聚糖酶能夠催化植物細胞中的半纖維素生成能夠利用的低聚木糖，在生產生活中有較多應用，包括食品、醫(yī)藥、飼料和生物能源等方面[15-16]。其中，不同來源的木聚糖酶在大腸桿菌中異源表達的報道最多[17]。雖然大腸桿菌繁殖速度快，操作方便，是比較理想的宿主細胞，但是由于蛋白質常存在于細胞內無法分泌至胞外，只能通過破壁的方法將目的蛋白釋放出來，從而增加酶的損失[18]。本研究成功構建了重組xynA在大腸桿菌中的分泌表達系統(tǒng)，通過正交試驗減少包涵體的形成，提高了胞外表達水平。從而降低工業(yè)生產中的成本，提高生產效率。同時對xynA 的酶學性質進行測定，最適反應溫度和pH分別為50 ℃和4.0，在pH為2.0～9.0都有較好的穩(wěn)定性，在飼料、生物乙醇等酸性制作過程中都有較高的使用潛力[19]。但由于在高溫下較差的穩(wěn)定性限制了其廣泛應用。

為了滿足實際生產時對熱穩(wěn)定性的要求，需要通過蛋白質工程對酶進行改造。本文構建的木聚糖酶表達菌株成功將xynA分泌至胞外，可通過定向進化或者理性改造技術提高該酶的熱穩(wěn)定性[20]。同時，利用易錯PCR、飽和突變等擴大突變文庫，并結合高通量篩選技術，大大方便正向突變株的篩選，為后續(xù)重組xynA的分子改造提供重要數據基礎[21]。