基于高通量測(cè)序分析紅棗枸杞浸泡酒對(duì)小鼠腸道菌群的影響

長(zhǎng)期過(guò)量飲酒會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂,肝臟功能受損[1],而適量飲酒能夠減少機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生,降低高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、癡呆等疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。

飲酒后,酒精主要通過(guò)胃腸道進(jìn)入體內(nèi),其中90%～98%由門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟進(jìn)行后續(xù)的分解代謝,其余以尿液、汗液及呼吸的形式排出體外。酒精在消化道中吸收與器官的表面積密切有關(guān),腸道由于具有腸絨毛等獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu),形成的黏膜表面積相對(duì)較大,是酒精在體內(nèi)吸收代謝的重要器官。人體腸道細(xì)菌總量約為人體細(xì)胞總數(shù)的10倍[4]。腸道微生物種類(lèi)繁多,以厚壁菌門(mén)(Firmicutes)及擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)為主(約占總腸道菌群90%以上)[5]。酒精作為典型的外源物質(zhì),能夠引發(fā)菌群在數(shù)量與組成上的變化。飲酒者空腸液細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),厭氧菌及需氧菌的相對(duì)豐度較未飲酒者明顯增加,在酒精性肝損傷動(dòng)物和人體模型中也觀察到同樣的結(jié)果[6-8]。在酒精暴露人群結(jié)腸組織檢查的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著增加而擬桿菌門(mén)豐度顯著降低[9]。宏基因組分析也證實(shí)了腸道菌群的多樣性且優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在攝入酒精后明顯發(fā)生改變[10-11]。此外,過(guò)度飲酒還會(huì)影響腸道黏膜屏障功能,造成腸道菌群易位。酒精的攝入會(huì)抑制多種與腸道屏障功能相關(guān)蛋白的表達(dá),如緊密連接蛋白(occludin and zona-occludens-1,ZO-1)、黏蛋白2(Mucin2)及胰島再生源蛋白3(Reg3)等[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),大鼠灌胃乙醇僅7 d就可以檢測(cè)到腸道細(xì)菌易位[14]。因此,在研究開(kāi)發(fā)含酒精類(lèi)功能飲品時(shí),有必要考察其對(duì)腸道菌群的影響。

隨著生活水平的提高,消費(fèi)者健康意識(shí)的增強(qiáng),白酒產(chǎn)品開(kāi)始向優(yōu)質(zhì)、低度、營(yíng)養(yǎng)健康、多品種方向發(fā)展,尤其是保健飲品開(kāi)始迅速發(fā)展和流行[15]。枸杞是一種傳統(tǒng)的中草藥,具有多種生物活性和藥理作用,可用來(lái)治療高脂血癥[16]、糖尿病[17]及癌癥[18]等疾病。紅棗含有蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、有機(jī)酸、氨基酸、維生素A、維生素C等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[19]。浸泡酒作為一種傳統(tǒng)的食品加工工藝,制作簡(jiǎn)便,成本低廉,一直以來(lái)受到廣泛的好評(píng)。本研究以紅棗枸杞為原料,蒸餾白酒為基酒制備浸泡酒,旨在探究功能性浸泡酒對(duì)小鼠腸道菌群的影響,為綜合利用低值農(nóng)產(chǎn)品,增加紅棗、枸杞附加值,進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有調(diào)節(jié)腸道菌群功能的保健酒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗、枸杞、濃香型蒸餾白酒(酒精度55%vol),無(wú)錫市歐尚超市；低聚果糖(分析純),上海麥克林生物技術(shù)有限公司。

FastDNA Spin Kit for Feces細(xì)菌基因組提取試劑盒,北京聯(lián)立信生物技術(shù)有限公司；PCR Clean Up Kit PCR純化試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Freezone Plus冷凍干燥機(jī),美國(guó)labconco公司；5830R型離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

以紅棗、枸杞為原料,洗凈晾干,紅棗去核后,與枸杞共同切成2 mm左右的薄片,紅棗、枸杞用濃香型蒸餾白酒以料液比1∶1∶10(g∶g∶mL)浸泡在陶罐中,加蓋密封后25 ℃避光貯存3個(gè)月,得到酒精度為50%vol的浸泡酒。

1.3.2 動(dòng)物分組

試驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級(jí)雄性c57/6 J小鼠,18～22 g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。試驗(yàn)設(shè)蒸餾酒對(duì)照組(10 mL/kg BW)、低聚果糖對(duì)照組(低聚果糖 1.0 g/kg BW)、紅棗枸杞浸泡酒低(10 mL/kg BW)、高(20.0 mL/kg BW)2個(gè)劑量組,每組10只。酒精劑量根據(jù)中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量(2013年版)成人(60 kg)的酒精每日最高攝入量(30 mL)換算為酒精體積分?jǐn)?shù)50%的浸泡酒,則推薦受試物成人每日攝入量為60 mL。換算為本次小鼠每日灌胃劑量為10.0 mL/kg BW,作為本次實(shí)驗(yàn)的低劑量組。高劑量組設(shè)為低劑量組的2倍,即20.0 mL/kg BW。根據(jù)參考文獻(xiàn)[20],對(duì)于含乙醇的受試樣品,如果乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)15%,允許將其體積分?jǐn)?shù)降至15%。因此將浸泡酒進(jìn)行旋蒸,將乙醇體積分?jǐn)?shù)降至15%,并調(diào)配至相應(yīng)劑量。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)周期及糞便采集

試驗(yàn)動(dòng)物在溫度為20～26 ℃、相對(duì)濕度為40%～70%的江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障設(shè)施SYXK(蘇)2021-0056飼養(yǎng)。輻照滅菌飼料和墊料均由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供,蘇飼證(2014)01008。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查批準(zhǔn),審批號(hào)JN.No20200710b0501030[148]。

實(shí)驗(yàn)共計(jì)21 d,前7 d為適應(yīng)期,第8～21天為灌胃期。小鼠飼養(yǎng)期間采用江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的動(dòng)物用水和飼料。第21天灌胃結(jié)束后收集小鼠糞便樣品,將單只小鼠轉(zhuǎn)移至獨(dú)立的已滅菌的鼠籠,采集新鮮糞便,置于冰上,2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,保存于-80 ℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束,腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(200 mg/kg)使小鼠安樂(lè)死。

1.3.4 DNA提取及測(cè)序

將小鼠糞便通過(guò)干冰運(yùn)送至華大基因測(cè)序公司,采用FastDNA Spin Kit for Feces 試劑盒提取小鼠糞便中的細(xì)菌基因組,設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,以稀釋后的基因組DNA為模板,擴(kuò)增16S rRNA基因V3和V4區(qū)(前端引物343F序列為5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′,后端引物798R序列為5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)。采用PCR Clean Up Kit試劑盒進(jìn)行PCR純化,文庫(kù)先由 Agilent Technologies 2100 bioanalyzer 進(jìn)行質(zhì)檢,按照 Illumina 的標(biāo)準(zhǔn)流程在 Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)上測(cè)序,產(chǎn)生 2×250 bp 的配對(duì)端序列[21]。

1.3.5 生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)束后,利用Trimmomatic軟件對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜,去雜后的雙端序列利用FLASH(fast length adjustment of short reads,v1.2.11)軟件進(jìn)行拼接,并利用UCHIME(v4.2.40)檢測(cè)去除序列中的嵌合體序列。測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后,采用USEARCH(v7.0.1090)軟件,按照97%的相似度進(jìn)行操作分類(lèi)單位(operational taxonomic unit,OTU)分類(lèi),對(duì)比Silva(version123)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋,得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種信息,物種比對(duì)注釋使用RDP classifier軟件,保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結(jié)果。對(duì)測(cè)得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)單元聚類(lèi)、OTUs豐度、Alpha/Beta多樣性分析?；诩S便微生物群在多種分類(lèi)水平上的相對(duì)豐度,統(tǒng)計(jì)分析不同組在各分類(lèi)水平上的顯著差異。利用PICRUSt1軟件將測(cè)序得到的菌群組成“映射”到KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)中,對(duì)菌群功能和代謝途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[22-23]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析,P<0.05為差異顯著。除特別說(shuō)明外,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表述。使用Origin 8.0和 Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌群alpha多樣性分析

由表1可知,Coverage指數(shù)均高于0.99,反映了此次測(cè)序深度已基本覆蓋到樣品中的所有物種。灌胃紅棗枸杞浸泡酒后,ACE指數(shù)相對(duì)蒸餾酒對(duì)照組雖無(wú)顯著性提高(P>0.05),但是從均值水平來(lái)看,具有增高的趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)分析顯示,實(shí)驗(yàn)后各組在Shannon和Simpson指數(shù)水平上無(wú)顯著差異(P>0.05),但是紅棗枸杞浸泡酒低、高劑量組Shannon指數(shù)均值大于蒸餾酒對(duì)照組,而Simpson指數(shù)均值小于蒸餾酒對(duì)照組,較大的Shannon指數(shù)與較小的Simpson指數(shù)可以反應(yīng)更高的菌群多樣性。綜上分析,雖然紅棗枸杞酒組相對(duì)于蒸餾酒對(duì)照組在alpha 多樣性指數(shù)水平上無(wú)顯著性差異,但是各指數(shù)均值呈現(xiàn)了增加或降低的變化趨勢(shì),表明紅棗枸杞浸泡酒在一定程度上可增加小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性。

表1 各組樣品的alpha多樣性分析

Table 1 Alpha diversity of fecal microflora in different groups

注：NC-蒸餾酒對(duì)照組；PC-低聚糖對(duì)照組；LD-浸泡酒低劑量組；HD-浸泡酒高劑量組(下同)

2.2 基于OTU豐度的主成分分析

為了探究不同組別之間的物種多樣性差異,基于樣本OTU的豐度對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析,采用的距離矩陣算法為Bray curtis(圖1)。通過(guò)主成分分析可知,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組發(fā)生明顯的分離[permutational multivariate analysis of variance(PERMANOVA)：P=0.001；R2=0.546],這表明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腸道菌群的物種結(jié)構(gòu)組成存在顯著性差異。

圖1 基于OTU豐度的主成分分析

Fig.1 Principal component analysis based on OTU abundance

2.3 門(mén)水平菌群組成及物種差異性分析

針對(duì)小鼠糞便樣本進(jìn)行了各分類(lèi)水平菌群組成分析,如圖2-a所示,在門(mén)水平上,擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)及厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在所有樣本中為主導(dǎo),平均占比>90%,其次為Proteobacteria、Verrucomicrobia、Actinobacteria、Tenericutes、TM7等,其他相對(duì)豐度<0.5%及未注釋的物種統(tǒng)一歸類(lèi)于Unclassified。通過(guò)Stamp軟件Tukey-Kramer算法對(duì)厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值進(jìn)行分析,結(jié)果如圖2-b所示,與蒸餾酒對(duì)照組相比,低劑量組、高劑量組、低聚糖組中厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)豐度比值顯著降低(P<0.05)。低、高劑量紅棗枸杞浸泡酒組相對(duì)于蒸餾酒對(duì)照組分別降低了50.87%和53.16%。研究表明,厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值的增加,與多種疾病如炎性腸病[24-25]、肥胖癥[26]及便秘[27-28]的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究結(jié)果表明,紅棗枸杞浸泡酒可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),適當(dāng)飲用可能具有改善相關(guān)病征的潛力,具體效果與機(jī)制需要進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

a-門(mén)水平相對(duì)豐度；b-厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)豐度比值

圖2 腸道菌群在門(mén)水平物種相對(duì)豐度及厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)豐度比值

Fig.2 Composition of gut microbiota at phylum level and ratio of Firmicutes to Bacteroides

注：不同小寫(xiě)字母代表組間具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.4 屬水平菌群組成及物種差異性分析

通過(guò)SPSS 25.0單因素ANOVA檢驗(yàn)中最低顯著性差異(least significant difference,LSD)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法對(duì)小鼠糞便樣本進(jìn)行了屬水平菌群組成分析,如圖3-a所示,對(duì)有顯著差異的物種進(jìn)行深入分析。結(jié)果表明,低、高劑量紅棗枸杞浸泡酒組在擬桿菌屬(Bacteroidetes,圖3-b)、梭狀菌屬(Clostridium,圖3-c)、乳桿菌屬(Lactobacillus,圖3-d)、阿德勒克羅伊茨菌屬(Adlercreutzia,圖3-e)及顫螺菌屬(Oscillospira,圖3-f)相對(duì)豐度水平上顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。WANG等[29]研究發(fā)現(xiàn)低聚糖類(lèi)如低聚果糖、低聚半乳糖及低聚異麥芽糖等可增加小鼠腸道內(nèi)容物中擬桿菌屬豐度,與實(shí)驗(yàn)中低聚糖對(duì)照組結(jié)果相同。而紅棗枸杞浸泡酒低、高劑量組在Bacteroidetes相對(duì)豐度上與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差別。已有研究發(fā)現(xiàn),Clostridium可通過(guò)刺激腸道細(xì)胞增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)物質(zhì)5-羥色胺的釋放,從而間接發(fā)揮促進(jìn)腸道蠕動(dòng)等益生作用[30]；且相關(guān)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)低聚糖的干預(yù)會(huì)增加Clostridium相對(duì)豐度[31-32]。另外,研究表明,Lactobacillus與維持腸道系統(tǒng)的微生態(tài)平衡、pH值和腸道上皮完整性有關(guān)[33-34],腸道內(nèi)Adlercreutzia、Oscillospira豐度的增加,可有效緩解腸易激綜合征、炎癥及肥胖相關(guān)病癥[35-36]。因此,以上各菌屬相對(duì)豐度的增加有利于宿主發(fā)揮明顯的益生功能。綜上所述,在屬水平上差異分析結(jié)果表明適當(dāng)飲用該浸泡酒可能具有優(yōu)化宿主腸道菌群結(jié)構(gòu),發(fā)揮益生功能的潛力。

a-屬水平相對(duì)豐度；b-擬桿菌屬;c-梭狀菌屬;d-乳桿菌屬;e-阿德勒克羅伊茨菌屬;f-顫螺菌屬

圖3 腸道菌群在屬分類(lèi)水平中物種相對(duì)豐度組成及組間物種相對(duì)豐度差異

Fig.3 The composition of gut microbiota at the genus level and the comparison of each group at the relative abundance of difference genus

2.5 糞便菌群預(yù)測(cè)功能的差異性分析

為進(jìn)一步了解紅棗枸杞浸泡酒對(duì)腸道菌群預(yù)測(cè)功能的改變,對(duì)各組樣品測(cè)序信息在 KEGG 代謝途徑第2水平上的功能差異進(jìn)行對(duì)比分析,結(jié)果如圖4所示。低劑量組腸道菌群預(yù)測(cè)功能在多糖生物合成代謝、氨基酸代謝及輔酶因子維生素代謝方面顯著高于蒸餾酒對(duì)照組(圖4-a),高劑量組腸道菌群預(yù)測(cè)功能在核苷酸代謝、復(fù)制和修復(fù)功能及其他氨基酸代謝功能方面顯著高于蒸餾酒對(duì)照組(圖4-b)。上述結(jié)果表明,攝入紅棗枸杞浸泡酒后,小鼠腸道菌群的一些代謝功能有一定的提高。結(jié)合圖3-a、圖3-b、圖3-d 結(jié)果可知,Bacteroidetes和Lactobacillus在腸道菌群結(jié)構(gòu)屬水平中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位,兩者相對(duì)豐度之和在各組中均大于50%。特別是在浸泡酒組中,兩者相對(duì)豐度之和大于70%。因此,可推測(cè)Bacteroidetes和Lactobacillus兩個(gè)屬相對(duì)豐度的變化將會(huì)顯著影響腸道菌群的功能。研究表明,擬桿菌屬中物種具有多種益生作用,可幫助宿主分解利用多糖,產(chǎn)生短鏈脂肪酸為宿主提供能量[37]。此外,在促進(jìn)腸黏膜的血管再生和免疫系統(tǒng)的發(fā)育方面也發(fā)揮著重要作用[38]。乳酸桿菌屬是益生菌研究的主要對(duì)象,該菌屬在改善胃腸道功能、增強(qiáng)免疫力等生理活動(dòng)上發(fā)揮著重要作用[33-34]。因此,可推測(cè)攝入紅棗枸杞浸泡酒后腸道菌群預(yù)測(cè)功能的差異可能主要是由腸道菌群相對(duì)豐度的變化引起的。

a-低劑量組與對(duì)照組；b-高劑量組與對(duì)照組

圖4 低劑量、高劑量組與對(duì)照組在小鼠糞便菌群預(yù)測(cè)功能上的差異

Fig.4 Differences between low/high dose groups and the control group at the predicted functions of mice fecal microbiota

3 結(jié)論

本研究基于高通量測(cè)序評(píng)價(jià)了紅棗枸杞浸泡酒對(duì)小鼠腸道菌群的影響,結(jié)果表明,各組與蒸餾酒對(duì)照組相比,小鼠腸道菌群均發(fā)生顯著變化。在門(mén)水平上,其厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)豐度比值顯著下降(P<0.05)；在屬水平上,乳酸菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬豐度顯著增加(P<0.05)；糞便菌群功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,攝入紅棗枸杞浸泡酒后,小鼠腸道菌群的一些代謝功能有一定的提高。綜上,可推測(cè)適當(dāng)飲用紅棗枸杞浸泡酒可能會(huì)調(diào)節(jié)宿主腸道菌群結(jié)構(gòu),促進(jìn)腸道中有益菌的增殖,具有改善腸道功能和維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定的潛力。