不同顏色小豆黃酮物質(zhì)差異分析

摘要：本研究采用高效液相色譜技術(shù)，分析16份不同粒色小豆品種中黃酮類物質(zhì)的組成與含量。結(jié)果顯示，淡褐色品種AG89的兒茶素衍生物含量最高，紅色品種Jingnong8的兒茶素及槲皮素衍生物3含量最高，紅底黑斑品種GM633的槲皮素衍生物1含量最高。此外，蘆丁僅在CCA001、Jingnong6等6個(gè)品種中檢出，米白色品種Norin3、AG110未檢測(cè)到該組分?；邳S酮類物質(zhì)含量的主成分分析結(jié)果表明，黃酮類化合物的組成與含量均與小豆品種及種皮顏色密切相關(guān)。

　 關(guān)鍵詞：小豆；種皮顏色；總黃酮含量（TFC）

　 小豆（Vigna angularis）是我國(guó)重要的食用豆類作物，其富含的黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、調(diào)節(jié)代謝等生理功能，是衡量小豆功能價(jià)值的核心指標(biāo)[1]。小豆種皮中的黃酮類化合物為多樣化群體，主要包括花青素、黃酮醇、異黃酮及原花青素等。這些化合物的組成與含量因小豆品種和種皮顏色不同而存在顯著差異[2]。種皮顏色是小豆的重要表型性狀，王明立等[3]通過(guò)對(duì)300余份小豆種質(zhì)資源的表型鑒定發(fā)現(xiàn)，小豆種皮顏色變異豐富，且與馴化進(jìn)程密切相關(guān)。李媛等[4]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，種皮顏色差異可能伴隨次生代謝產(chǎn)物的分化，但關(guān)于不同種皮顏色小豆黃酮含量的系統(tǒng)研究仍較匱乏。

　 本研究以16份不同粒色小豆品種（涵蓋8種種皮顏色）為材料，測(cè)定7種黃酮組分（兒茶素衍生物、兒茶素、槲皮素衍生物1-3、蘆丁、牡荊素衍生物）及總含量，結(jié)合主成分分析（PCA），深入探究不同粒色小豆黃酮類物質(zhì)的品種差異、組分特異性及與種皮顏色的關(guān)聯(lián)性，為小豆功能型育種與功能食品開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐及種質(zhì)資源。

　 一、材料與方法

　 （一）供試材料

　 供試的16個(gè)小豆品種均來(lái)源于多樣性豐富的小豆種質(zhì)資源庫(kù)，由北京農(nóng)學(xué)院小豆創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)收集提供。

　 （二）試劑與儀器

　 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）、高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、分析天平（感量0.0001g）、渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、超聲波振蕩器（深圳市科潔超聲科技有限公司）、離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5804R）、甲醇（分析純）、濾膜（0.45μm）、一次性注射器（1mL）、進(jìn)樣瓶（2mL）、乙腈（色譜純）、甲酸（質(zhì)譜純）、山奈酚、牡荊素、槲皮素、兒茶素（黃酮標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

　 （三）方法

　 1. 小豆樣品收集

　 小豆籽粒完全成熟后收獲，收獲后將籽粒置于通風(fēng)陰涼處自然晾干，去除破損粒、蟲(chóng)蛀粒及雜質(zhì)。將處理后的籽粒保存于4℃冰箱，用于后續(xù)黃酮類物質(zhì)提取與檢測(cè)。

　 2. 黃酮類物質(zhì)提取

　 將保存的小豆籽粒放入高速萬(wàn)能粉碎機(jī)中粉碎磨細(xì)，過(guò)100目篩，隨后置于42℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥過(guò)夜，以消除水分對(duì)提取效率的影響。精確稱取干燥后的小豆粉末0.2g（精確至0.0001g），置于2mL離心管中，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。向離心管中加入1mL 80%甲醇（分析純），經(jīng)渦旋儀渦旋處理10min，使樣品與溶劑充分混合。之后將離心管置于超聲波振蕩器中，在40Hz條件下超聲提取90min；超聲結(jié)束后，將離心管放入離心機(jī)，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，小心倒出上清液至新離心管中，上清液即為黃酮類物質(zhì)提取液，待檢測(cè)。

　 3. 黃酮類物質(zhì)檢測(cè)

　 （1）總黃酮含量測(cè)定。采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測(cè)定總黃酮含量：將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于42℃干燥至恒重，精確稱取7.5mg，用50%二甲基亞砜溶解并定容至50mL，制成標(biāo)準(zhǔn)母液；稀釋得到10、20、30、40、50、60、75μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)液，以50%二甲基亞砜為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程。取100μL樣品提取液，依次加入800μL超純水、60μL 5% NaNO2（靜置5min）、60μL 10% AlCl3（靜置10min）、400μL 1mol/L NaOH，用超純水補(bǔ)至2mL并混勻；以超純水為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按回歸方程計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果以mg蘆丁當(dāng)量（RE）/g表示。

　 （2）黃酮組分定性與定量檢測(cè)。 取黃酮類物質(zhì)提取液，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后注入2mL進(jìn)樣瓶待上樣。采用Phenomenex C18色譜柱（2.1mm×50mm，1.8μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為色譜純乙腈；梯度洗脫程序：5% B維持1min，9min內(nèi)升至25% B，10min內(nèi)升至100% B（持續(xù)至10.5min），11min恢復(fù)至5% B；流速0.3mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量2μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。對(duì)照兒茶素、槲皮素、蘆丁、牡荊素標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)合保留時(shí)間、紫外吸收光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)（分子離子峰、碎片離子峰）進(jìn)行黃酮組分定性；以各組分標(biāo)準(zhǔn)品繪制峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量，結(jié)果以mg/g表示。

　 4. 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

　 采用IBM SPSS Statistics 17（IBM Corp. USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。

　 二、結(jié)果與分析

（一）不同顏色小豆種皮黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

　 黃酮類化合物具有抗氧化活性與著色能力[5]，主要以葡糖苷形式存在于小豆種皮中，其種類與含量均與小豆種皮顏色及品種相關(guān)[6]。16份小豆品種的7種黃酮組分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。在16個(gè)品種小豆種皮中共檢測(cè)到7種黃酮組分，分別為兒茶素衍生物、兒茶素、槲皮素衍生物1-3、蘆丁、牡荊素衍生物。兒茶素衍生物含量以淡褐色品種AG89最高，米白色品種Norin3最低，二者差異達(dá)13.5倍。兒茶素含量以紅色品種Jingnong8最高，米白色品種Norin3仍為最低。槲皮素衍生物1含量最高值出現(xiàn)在紅底黑斑品種GM633，顯著高于其他品種（P<0.05），最低值為米白色品種Norin3；槲皮素衍生物2和3的高含量品種集中于紅色種皮，其中Jingnong22的槲皮素衍生物2含量最高，Jingnong8的槲皮素衍生物3含量最高；牡荊素衍生物含量以紅底黑斑品種CCA004最高，紅色品種Jingnong8和灰底黑斑品種GM977最低；蘆丁含量在部分品種中未檢出，檢出品種中以紅色Jingnong23含量最高，黑色品種AG118最低。

　 圖1 小豆種皮黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果（mg/g）

　 （二）基于小豆種皮黃酮含量的主成分分析

為進(jìn)一步探究不同粒色小豆與黃酮類物質(zhì)組成及含量的關(guān)聯(lián)性，明確品種間差異特征，對(duì)16個(gè)小豆品種的7種黃酮組分及總黃酮含量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果如圖2。由圖2可知，兩個(gè)主成分共解釋76.1%的總方差（主成分1為53.5%，主成分2為22.6%）。

　 從x軸方向看，主成分1可將16個(gè)小豆品種清晰劃分為三大類群：淡褐色品種AG89、灰底黑斑品種GM977位于x軸負(fù)向區(qū)域；米白色品種Norin3、AG110及紅底黑斑品種CCA004、GM633位于x軸正向區(qū)域；紅色、綠色、橙色、黑色品種集中于x軸中間區(qū)域。結(jié)合圖1可知，位于x軸負(fù)向的AG89和GM977，其兒茶素衍生物含量和總黃酮含量顯著高于其他品種；位于x軸正向的米白色品種，黃酮組分含量均為最低，紅底黑斑品種則以槲皮素衍生物1高含量為特征；中間區(qū)域品種黃酮組成更具多樣性，紅色品種富含槲皮素衍生物2-3，綠色品種含少量蘆丁，黑色品種組分均衡，故聚集于原點(diǎn)附近。

　 主成分2可進(jìn)一步細(xì)化中間區(qū)域品種的分類：橙色品種AG163、GM170及部分紅色品種位于y軸正向區(qū)域；綠色品種CCA001、灰底黑斑品種GM977及淡褐色品種GM13位于y軸負(fù)向區(qū)域。結(jié)合圖1可知，位于y軸正向的品種AG163，其牡荊素衍生物含量相對(duì)較高，且未檢出蘆?。晃挥趛軸負(fù)向的品種中，CCA001是少數(shù)檢出蘆丁的品種，GM977則因黃酮組分均衡但無(wú)突出高含量組分。此外，所有品種均分布于置信區(qū)間內(nèi)，無(wú)異常樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證了分類結(jié)果的穩(wěn)定性。

圖2 基于小豆種皮黃酮類物質(zhì)的主成分分析得分圖

　 三、結(jié)論

　 本研究以16份不同粒色小豆品種為材料，采用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)7種黃酮組分含量，結(jié)合主成分分析（PCA）開(kāi)展研究。結(jié)果表明，不同粒色小豆黃酮組成與含量差異顯著，淡褐色、灰底黑斑及紅色品種總黃酮含量顯著高于其他粒色，其中AG89（淡褐色）和GM977（灰底黑斑）含量最高；組分方面，淡褐色品種富含兒茶素衍生物，紅色品種富含兒茶素及槲皮素衍生物2-3，紅底黑斑品種槲皮素衍生物1含量突出，蘆丁僅在6個(gè)品種中檢出，米白色品種未檢測(cè)到該組分。PCA可清晰區(qū)分供試品種，表明黃酮組成及含量與小豆品種、種皮顏色密切相關(guān)，受遺傳調(diào)控。本研究為高黃酮小豆種質(zhì)篩選、功能型育種及相關(guān)功能食品開(kāi)發(fā)提供了重要依據(jù)。

文章來(lái)源：《農(nóng)業(yè)科技報(bào)》http://m.00559.cn/w/sci/26919.html