抑制性消減雜交技術在水產(chǎn)無脊椎動物中的應用

    自20年前，由于分子生物的迅猛發(fā)展與物種基因組全序列測定計劃的逐漸結束，分子生物學的研究重心已轉向表達調控功能與基因功能研究。抑制性消減雜交(SSH)技術是一種鑒定、分離、篩選組織細胞中未知基因表達的新技術，它與抑制PCR與消減雜交相結合，具有靈敏度高、操作簡便、假陽率低于特異性強等優(yōu)點，逐漸被學界視為應用前景最看好的一種分子生物學研究方法。

一、抑制性消減雜交(SSH)技術的原理

    抑制性消減雜交(SSH)技術是在抑制性PCR的基礎上，結合消減雜交步驟與均等化檢驗子DNA單鏈步驟，簡單快捷地分離差異基因的方法，即富集差異序列，消減同源序列。

    這一方法根據(jù)雜交二級動力學，使分子間原有單鏈DNA的豐度差異消失、DNA相對含量趨同。抑制性PCR指根據(jù)鏈間退火弱于鏈內(nèi)退火并且鏈內(nèi)退火更為穩(wěn)定的動力學特性，非目的序列片段兩端反向重復序列退火時分離出鍋柄形態(tài)的互補結構，使其不能與引物配對與作為模板，從而選擇性地使得非目的基因片段難以擴增。而在均等基因群的標準化步驟中，消減雜交能起到去除驅趕基因群和目的基因群之間的共有基因序列的作用，以正常擴增基因的不同序列。

二、抑制性消減雜交(SSH)技術的優(yōu)缺點

2.1 優(yōu)點：在鑒定、分離、篩選與克隆差異表達的基因序列片段中，這種方法更適用于差異表達的新基因的發(fā)現(xiàn)；這種方法一般情況下4天左右就能得到差異表達基因片段的cDNA，其篩選周期比較低；一次抑制性消減雜交反應就能夠分離上百個差異表達基因，效率非常高；這一技術成熟、簡單、易操作掌握。

2.2 缺點：這一技術對材料的要求高，所采用的材料背景差異不能過大；消減文庫中cDNA不能被酶完全消化，全長的cDNA無法通過此技術獲取，因此cDNA非全長；對模板需求量高，mRNA不符合要求量則很有可能將導致低豐度的cDNA難以被檢測出來。

三、抑制性消減雜交(SSH)技術在水產(chǎn)無脊椎動物中的應用

3.1 對發(fā)育與生殖相關基因的研究

    由于受到不同基因組的調控，無脊椎動物胚胎發(fā)育的各個階段都會產(chǎn)生分化出不同的器官與組織，該技術能對這些基因進行鑒定與分離。在研究相關基因調控蝦的卵子發(fā)生過程時，有國外生物學家使用此技術建立了日本囊對蝦卵巢的DNA庫，發(fā)現(xiàn)在核糖體蛋白的精子或卵巢的基因表達量上有著不小的差異[1]。經(jīng)過分析得出，相對與肝臟、胰腺、睪丸、眼肌，卵巢中的核糖體蛋白含量要大得多。我國研究者陳金平使用抑制性消減雜交(SSH)技術建立了銀鯽心跳起始期與尾芽期的特異性質庫，篩選這兩個階段的特異性基因，與中科院生物研究中心數(shù)據(jù)庫進行比較，得出心跳起始期絕大部分為已知基因，而232個尾芽期的雜交克隆中有155個可能是未知基因。這在很大程度上為分子生物學的分機機理研究做出了貢獻。

3.2 差異表達基因的篩選

    在水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖中，其環(huán)境往往受到溶解氧、鹽度與水溫的影響。美國生物學家Mercury等對太平洋牡蠣進行試驗，研究在缺氧的條件下太平洋牡蠣的反應；日本生物學家福川對使用抑制性消減雜交(SSH)技術對草蝦基因表達情況的影響進行研究，這種技術在低滲、低氧和高溫的情況下研究草蝦血細胞內(nèi)轉座子和免疫相關基因的表達情況也被廣泛應用[2]。

    此外，還可通過抑制性消減雜交(SSH)文庫的建立，對水產(chǎn)動物在污染水環(huán)境狀況下機能的適應程度進行實驗分析，從而有利于基因差異表達的發(fā)現(xiàn)及篩選出相應基因。瑞典科學家Manse在2009年研究了后期扇貝幼蟲遭到銅離子的脅迫后的基因差異表達，發(fā)現(xiàn)了89個cDNA，其中57個可能為未知功能，32個為已知功能[3]。

四、結論

    抑制性消減雜交(SSH)技術是一種鑒定、分離、篩選組織細胞中未知基因表達的新技術，是在抑制性PCR的基礎上，結合消減雜交步驟與均等化檢驗子DNA單鏈步驟，簡單快捷地分離差異基因的方法。

    抑制性消減雜交(SSH)技術能對無脊椎動物胚胎發(fā)育的各個階段中產(chǎn)生分化出的不同的器官與組織的基因進行分離與鑒定。同時，這種技術對水產(chǎn)動物養(yǎng)殖環(huán)境在受到溶解氧、鹽度與水溫的脅迫時，也能篩選出水產(chǎn)養(yǎng)殖生物差異表達的生理功能相關基因。此外，水產(chǎn)動物在水污染環(huán)境下的生理功能適應程度也可以對比抑制性消減雜交(SSH)庫進行研究，從而篩選出差異表達基因。

【參考文獻】

[1]李小慶，景志忠. 抑制性消減雜交技術的應用[J].生物技術通報，2009（05）158—162.

[2]單曉楓，孫佳敏，張洪波等. 抑制性消減雜交技術及其在水生動物基因克隆中的應用[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2010（09）：243—249.

[3]楊倩，成軍，劉妍等. 抑制性消減雜交技術原理及應用[J].世界華人消化雜志，2008（11）：376—280.